EZH2抗卵巢癌失巢凋亡的研究.pdf

1、目的：
　　本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)EZH2可促進卵巢癌的腹腔種植，但機制不明。本研究旨在探究卵巢癌細胞中高表達的EZH2抗失巢凋亡的作用。
　　方法：
　　1.建立失巢凋亡模型：用poly-HEMA包被的培養(yǎng)板建立卵巢癌細胞SKOV3和A2780的失巢凋亡模型，觀察懸浮培養(yǎng)的卵巢癌細胞SKOV3和A2780的形態(tài)變化；
　　2.卵巢癌失巢凋亡模型的鑒定：Annexin V-FITC/PI檢測懸浮培養(yǎng)不同時間點(0h

2、/12h/24h/48h/72h/96h)的卵巢癌細胞SKOV3及A2780的凋亡改變；
　　3.卵巢癌細胞失巢狀態(tài)下生物學特性的變化：分別通過劃痕愈合實驗、Transwell遷移實驗和EDU實驗檢測SKOV3和A2780細胞懸浮培養(yǎng)48h后遷移能力和增殖能力的變化；
　　4.卵巢癌細胞失巢狀態(tài)下EZH2表達的變化：Western-blot技術(shù)檢測卵巢癌細胞SKOV3和A2780懸浮培養(yǎng)不同時間點(0H/12H/24H/48

3、H/72H/96H)的EZH2表達水平；
　　5.慢病毒轉(zhuǎn)染下調(diào)EZH2后對失巢凋亡的影響：利用慢病毒轉(zhuǎn)染EZH2短發(fā)夾RNA（shRNA）沉默EZH2的表達，用嘌呤霉素篩選單克隆抗體，建立EZH2低表達的SKOV3穩(wěn)轉(zhuǎn)株（SKOV3 shEZH2）和其相對應的對照空載體細胞（SKOV3 shNC）,用western-blot檢測SKOV3的轉(zhuǎn)染效率；SKOV3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株SKOV3 shEZH2及其對照組SKOV3 shNC懸浮培

4、養(yǎng)48h后，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，比較其凋亡率的變化；
　　6.藥物對失巢凋亡的影響：用特異性EZH2抑制劑Dznep、GSK126作用于卵巢癌細胞SKOV3，DMSO為對照，流式細胞儀檢測懸浮培養(yǎng)48h后不同處理組的卵巢癌細胞的凋亡率；
　　7.動物實驗檢驗EZH2對凋亡的影響：取本實驗組前期建立的SKOV3 shEZH2和SKOV3 shNC裸鼠腹腔種植瘤模型的瘤體標本切片后TUNEL法檢測凋亡的表達；免疫組化檢測各

5、標本中EZH2，Ki67，cleaved-caspase-3的表達。
　　結(jié)果：
　　1. SKOV3細胞貼壁生長呈不規(guī)則多角形，A2780細胞呈長梭形。懸浮培養(yǎng)后SKOV3和A2780細胞的形態(tài)學發(fā)生明顯改變，細胞體積變小，回縮為球形，48h后SKOV3可形成大而疏散的細胞團，而A2780細胞則形成小而致密的細胞球。
　　2.流式細胞儀檢測卵巢癌細胞SKOV3在懸浮培養(yǎng)48h后細胞凋亡進入穩(wěn)態(tài)，而A2780細胞的凋亡

6、率呈時間依賴性增高。
　　3.與貼壁細胞相比懸浮培養(yǎng)48h后重貼壁SKOV3和A2780細胞的增殖能力未見明顯改變（P>0.05，差異無統(tǒng)計學意義）；SKOV3遷移能力明顯增強（P<0.05，有統(tǒng)計學差異），而A2780細胞遷移能力未見明顯變化（P>0.05，差異無統(tǒng)計學意義）；
　　4.Western-blot結(jié)果顯示：卵巢癌細胞SKOV3隨懸浮培養(yǎng)時間的增加EZH2蛋白表達水平逐漸降低，至48h后EZH2的表達趨于穩(wěn)定，

7、而卵巢癌細胞A2780隨懸浮培養(yǎng)時間的延長，EZH2的表達水平未見明顯改變；
　　5.SKOV3細胞懸浮培養(yǎng)48h后，與對照組DMSO相比，EZH2抑制劑DZNEP（1μg/ml）和GSK126（1μg/ml）處理組細胞凋亡增多；同時SKOV3 shEZH2在懸浮培養(yǎng)48h后的凋亡與對照組SKOV3 shNC相比明顯增高；
　　6.裸鼠腹腔種植后瘤體免疫組化及TUNEL實驗結(jié)果顯示：與SKOV3 shNC組相比，SKOV3