NaC1處理下幾種紅樹植物滲透調(diào)節(jié)特征和蛋白表達差異研究及擬南芥AtNHX的亞細胞定位.pdf

1、紅樹植物由于長期生活在高鹽度的海水環(huán)境中，具有十分有效的耐鹽機制，是研究植物尤其是木本植物耐鹽機理的絕好材料。本文研究了不同濃度NaCl處理對秋茄(Kandelia candel)、木欖(Bruguiera gymnorrhiza)、白骨壤(Avicenniamarina)和桐花樹(Aegiceras corniculatum)四種紅樹植物葉片滲透調(diào)節(jié)特征的影響；分析了不同濃度NaCl處理45 d后三種紅樹植物(秋茄、桐花樹和木欖)葉片

2、的蛋白質(zhì)組；研究了模式植物擬南芥Na+/H+逆向轉運蛋白AtNHX2、AtNHX3、AtNHX5和AtNHX6的亞細胞定位。主要結論如下：
　　 1.本實驗對不同鹽濃度處理下四種紅樹植物幼苗葉片的滲透調(diào)節(jié)機制進行了研究。實驗中分別采用無鹽(0 mM NaCl)、中等鹽度(200 mM NaCl)和高鹽度(用500 mM NaCl處理秋茄、木欖和桐花樹；600 mM NaCl處理白骨壤)三種不同的鹽濃度，分別在鹽處理后0、7、15

3、、30和45 d取樣，分析四種紅樹植物葉片中各種無機離子和有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，以及它們對總滲透勢的貢獻率，并比較了非泌鹽紅樹與泌鹽紅樹在滲透調(diào)節(jié)機制上的異同。
　　 研究結果表明，非泌鹽紅樹與泌鹽紅樹表現(xiàn)出不同的滲透調(diào)節(jié)機制，即在高鹽度處理下，無機離子對泌鹽紅樹植物的滲透調(diào)節(jié)貢獻作用比非泌鹽紅樹植物更加重要，高鹽度處理45 d后，無機離子貢獻率在泌鹽紅樹植物中平均比非泌鹽紅樹植物中高出約16％，并且，非泌鹽紅樹植物的無機離子

4、貢獻率在高鹽度處理下低于中等鹽度處理。該結果表明非泌鹽紅樹植物對Na+和Cl-的耐受能力低于泌鹽紅樹，在高鹽度下更多轉向對有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累，而泌鹽紅樹植物體內(nèi)可能存在特殊的耐受高濃度Na+和Cl-的機制，有利于它們更好的適應高鹽度環(huán)境。
　　 非泌鹽紅樹與泌鹽紅樹在滲透調(diào)節(jié)機制上還存在相同之處，即無機離子是四種紅樹植物應對鹽生生境的最重要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，Na+和Cl-在其中占了最大比例，貢獻了超過一半的滲透勢；有機滲透調(diào)節(jié)物

5、質(zhì)的作用較小，并隨著NaCl處理濃度的提高和時間延續(xù)而逐漸減低。K+對四種紅樹植物的滲透調(diào)節(jié)作用在鹽處理下都被減弱，Na+/K+比值在實驗后期都大于2，但是，K+在四種紅樹植物中都保持了較高的含量，在各種處理條件下都高于100 mM，這可能是紅樹植物有效的耐鹽機制之一；可溶性糖和K+都是四種紅樹植物中無鹽處理時重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，但它們的滲透調(diào)節(jié)貢獻率受鹽處理而降低，在無鹽處理下的貢獻作用更大；脯氨酸的含量受鹽處理都提高，但滲透貢獻率不

6、足0.2％，對滲透調(diào)節(jié)的貢獻作用不大。
　　 不同紅樹植物還具有不同的滲透調(diào)節(jié)特性。如總游離氨基酸的貢獻率在秋茄和白骨壤中受鹽處理提高，在木欖和桐花樹中則受鹽處理而降低。從整個細胞水平看，甘氨酸甜菜堿(GB)對滲透調(diào)節(jié)的作用不太大，但是考慮到它在胞質(zhì)中的特異分布，GB可能對白骨壤葉片細胞質(zhì)的滲透調(diào)節(jié)有非常重要的作用。從秋茄葉片中的松醇和甘露醇以及桐花樹葉片中的有機酸對總滲透勢的貢獻率來看，多元醇和有機酸在紅樹植物中的滲透調(diào)節(jié)作用

7、也十分有限。
　　 2.通過雙向電泳分離及質(zhì)譜分析鑒定，對0mM、200mM和500mM三種不同濃度NaCl處理45d后紅樹植物(秋茄、桐花樹和木欖)葉片的差異蛋白質(zhì)組學進行了研究，這是首次對秋茄和桐花樹蛋白質(zhì)組研究的報道。結果表明，不同濃度NaCl處理導致三種紅樹植物的2-DE凝膠表達圖譜發(fā)生了變化，其中秋茄葉片中有22個蛋白質(zhì)表達量改變，桐花樹和木欖葉片中分別有21個和22個蛋白表達量發(fā)生變化。經(jīng)MALDI-TOF/MS分析

8、鑒定，秋茄葉片HSC70和HSP60在高鹽脅迫下表達量發(fā)生改變，表明熱激蛋白(Heat shock proteins，HSPs)在秋茄適應鹽生環(huán)境的過程中起了作用。經(jīng)MALDI-TOF/MS分析鑒定，桐花樹葉片核糖體失活蛋白(Ribosome inactivating protein，RIP)在鹽處理下被誘導表達，SNARE蛋白可能通過在鹽處理下降低表達而減少ROS對液泡的傷害，從而提高桐花樹的抗鹽性。
　　 LC-MS/MS對

9、木欖葉片差異表達的10個蛋白質(zhì)進行了成功的鑒定，結果表明，chCpn60、Rubisco活化酶(Rubisco activase，RCA)、HSP、谷胱甘肽轉移酶(Glutathione transferase，GST)、短鏈脫氫/還原酶(Short-chaindehydrogenase/reductase，SDR)、肌動蛋白和一個未知蛋白等協(xié)同作用參與木欖的鹽脅迫響應，未知蛋白的發(fā)現(xiàn)有利于揭示紅樹植物新的耐鹽機制。木欖在兩種不同濃度N

10、aCl處理下調(diào)控機制有所不同，在高鹽和中等鹽度處理下木欖分別通過chCpn6和RCA的作用間接保護光合作用。此外，木欖在高鹽脅迫下積累肌動蛋白以保護細胞骨架結構；中等鹽度處理下木欖提高GST以清除體內(nèi)多余活性氧，起到抗氧化作用；SDR表達量在中等鹽度處理下降低，可能減少通過ABA介導的對滲透脅迫響應的信號轉導途徑，表明在適宜鹽度下生長的木欖可減少對體內(nèi)生理功能的調(diào)控，更好的保持細胞穩(wěn)態(tài)。
　　 3.研究了模式植物擬南芥Na+/H

11、+逆向轉運蛋白AtNHX2、AtNHX3、AtNHX5和AtNHX6的亞細胞定位情況，以便為研究紅樹植物的Na+/H+逆向轉運蛋白提供更好的理論基礎。運用Gateway技術構建了以CaMV35S啟動子驅動的融合GFP(或YFP)的植物表達載體，通過基因槍轟擊使之在洋蔥表皮細胞中瞬時表達，也通過花序浸染法轉化擬南芥穩(wěn)定表達，再利用熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡檢測熒光蛋白的表達情況，本實驗首次報道了對AtNHX3、AtNHX5和AtNHX6

12、的亞細胞定位研究。實驗結果表明，在洋蔥表皮細胞中瞬時表達AtNHX2-YFP和AtNHX3-YFP發(fā)現(xiàn)，AtNHX2和AtNHX3主要定位于液泡膜；對洋蔥表皮細胞和擬南芥植株中表達AtNHX5-YFP的觀察發(fā)現(xiàn)，AtNHX5沒有定位于質(zhì)膜或液泡膜，可能在內(nèi)涵體/液泡前體等內(nèi)膜系統(tǒng)上。AtNHX5在洋蔥細胞和擬南芥細胞中運動或沿類似TVS(Transvacuolar cytoplasmic strand，TVS)的結構運動，表明AtNHX