腐皮鐮孢菌殼聚糖酶CSN1的基因克隆、表達及其對致病性影響的研究.pdf

1、殼寡糖(Chitooligosaccharides)是由氨基葡萄糖以β-1,4-糖苷鍵縮合而成的低聚物,聚合度一般為2-20,具有較低的分子量,呈水溶性,易于被細胞吸收,具有多種生物學活性,廣泛應用于醫(yī)藥、保健、日化、農業(yè)、生防等領域,有著廣闊的市場前景,是近年來研究和開發(fā)的熱點之一。
　　 殼寡糖主要由殼聚糖(Chitosan)降解產生,而殼聚糖是由自然界中儲量最為豐富的含氮類有機化合物甲殼素(Chitin)脫乙?；纬傻?。目

2、前殼寡糖的制備方法主要有殼聚糖化學降解法和酶解法?；瘜W法包括濃酸降解法和過氧化氫降解法,但兩種方法都較難得到低聚合度的殼寡糖,而且反應條件劇烈,容易引發(fā)環(huán)境問題。酶解法具有反應條件溫和,殼寡糖得率高,不造成環(huán)境污染等優(yōu)點。殼寡糖的酶法制備,又分為復合酶解法和專一性酶解法。復合酶解法是混合利用多種水解酶類,包括纖維素酶,蛋白酶,脂肪酶等,共同降解殼聚糖產生不同聚合度的殼寡糖。而專一性酶解法是利用殼聚糖的專一性水解酶一殼聚糖酶(Chitos

3、anase)水解殼聚糖制備殼寡糖的過程。從殼寡糖的轉化率、產物分子量分布范圍、酶解產品的質量穩(wěn)定性和酶解過程的可重復性來講,利用專一性酶解法制備殼寡糖最具有前景和發(fā)展優(yōu)勢。殼寡糖市場前景的廣闊促使了殼聚糖酶研究的活躍,目前已在多種微生物中分離到了殼聚糖酶,并對其酶學性質、水解機制進行了研究,其中以內切型殼聚糖酶最適合于殼寡糖的生產。
　　 釀酒酵母是非常理想的真核生物表達系統(tǒng),具有原核細菌所沒有的真核生物蛋白翻譯后修飾加工系統(tǒng)和

4、安全型基因工程受體系統(tǒng),并能將外源基因表達產物分泌至培養(yǎng)基中,已廣泛用于外源基因的表達。釀酒酵母同時也是廣泛用于工業(yè)生產的經濟微生物,具有培養(yǎng)條件簡單、生長迅速,便于大規(guī)模、高密度發(fā)酵,公認的生物安全菌(GRAS),高抗逆性等優(yōu)良工業(yè)生產特性。
　　 腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)在世界范圍內分布廣泛,可在土壤中長期進行腐生生活,同時也可寄生危害寄主植物。由于其在農業(yè)生產上的嚴重危害,腐皮鐮孢菌受到了廣泛關注。Ha

5、dwiger(1980,1981)在研究F.solani與豌豆(Pisumsativum)的相互作用時發(fā)現(xiàn),從F.solani細胞壁上釋放出的殼寡糖類能夠啟動豌豆的防御機制,誘導豌豆細胞植保素(Phytoalexin)的產生,從而提高其抗病性,抑制F.solani的侵染,并通過免疫化學的方法檢測到殼寡糖從F.solani細胞壁上釋放出來,進入植物細胞中。Prapagdee(2007)研究發(fā)現(xiàn)低濃度的外源性殼聚糖類就能夠抑制F.solan

6、i的生長,保護豌豆免于病原真菌引發(fā)的猝死綜合癥(Sudden death syndrome)。鑒于殼聚糖和殼寡糖在病原真菌與植物相互作用中扮演著重要的角色,Shimosaka(1993)曾推測F.solani殼聚糖酶可能與真菌細胞壁的降解或致病性有關,但關于真菌殼聚糖晦生理功能的研究極少,至今尚沒有實驗性的證據(jù)被報道。
　　 本實驗室前期研究中利用平板透明圈法結合薄層層析法(TLC),篩選到一株能分泌表達殼聚糖酶的腐皮鐮孢菌F.

7、solani0114。對粗酶液的研究表明該菌所產殼聚糖酶的水解產物中不含單糖,水解產物的平均分子量為1.3kDa,殼寡糖比例較高。本論文的主要研究工作包括:1.F.solani殼聚糖酶基因的克隆及酶學性質研究
　　 利用RT-PCR方法擴增得到F.solani0114殼聚糖酶的cDNA序列,序列分析表明該cDNA中包含一個編碼300個氨基酸殘基的開放讀碼框(ORF,903bp)。該序列已提交至GeneBank,登錄號為EU263

8、917。將此序列N末端與His標簽融合并在大腸桿菌DE3中異源表達,通過對該重組酶的鎳柱純化,透析復性,得到了純化的殼聚糖酶CSN1。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示CSN1的分子量約為30kDa,酶學性質分析表明CSN1的最適溫度為50℃,最適pH值為5.6,以脫乙酰度85％的殼聚糖為底物時Km值為0.063mg/ml,Vmax為126.58μmol/ml.min,比酶活為2.5U/mg。利用薄層層析法(TLC)和高效液相色譜技術(HPL

9、C)對CSN1的酶解產物進行分析,結果表明,水解產物中不含單糖,10糖以下組分占75％以上,為內切型殼聚糖酶。本研究得到的殼聚糖酶CSN1非常適合于殼寡糖的專一性酶解法生產。
　　 2.CSN1在釀酒酵母工業(yè)菌株中的表達
　　 將CSN1的cDNA序列與克魯維酵母的菊粉酶(INU1A)信號肽序列融合,以實驗室前期構建的多拷貝整合性釀酒酵母表達載體pYMIKP質粒為骨架,構建得到CSN1表達質粒pYMIKP-CHO,并將該

10、質粒導入釀酒酵母N-27中,搖瓶發(fā)酵實驗表明,釀酒酵母重組菌株N-27C所產殼聚糖酶粗酶液的體積酶活達到50.2mU/ml,成功實現(xiàn)了CSN1在釀酒酵母中的分泌表達,TLC法酶解產物分析表明,重組殼聚糖酶的酶解特性與純酶及F.solani0114所產殼聚糖酶相一致。釀酒酵母重組菌株的構建對于CSN1的規(guī)?；a具有潛在的應用價值。
　　 3.根癌農桿菌介導的腐皮鐮孢菌轉化體系的建立
　　 選擇兩種轉化篩選標記:潮酶素B(

11、Hygromycin B)和草丁磷除草劑(PPT)測定其對腐皮鐮孢菌孢子生長的最低抑制濃度,結果顯示:400μg/ml潮霉素B或750μg/mlPPT能夠完全抑制F.solani0114孢子的萌發(fā)和生長。以質粒pCAMBIA1300為骨架,構建適合腐皮鐮孢菌轉化的雙元載體pCABAR和pCAHPH,將構建好的質粒轉入根瘤農桿菌LBA4404,利用根瘤農桿菌介導的轉化技術(ATMT)轉化腐皮鐮孢菌F.solani0114。根據(jù)前期本實驗室

12、對ATMT的研究結果,采用400μg/ml AS,6h預培養(yǎng)時間處理用于轉化的根瘤農桿菌,根瘤農桿菌與腐皮鐮孢菌孢子的共培養(yǎng)時間為48小時。并對根瘤農桿菌與真菌孢子比進行優(yōu)化,結果顯示根瘤農桿菌與真菌孢子比為1.0/106·ml-1時轉化效果較好。測定了兩種選擇標記:bar和hph對轉化效率的影響。結果顯示以bar為選擇標記時,轉化效率為13轉化子/106孢子；以hph為選擇標記時,轉化效率為21轉化子/106孢子。與PEG-CalCl

13、2轉化法相比(27轉化子/107原生質體),ATMT法具有較高的轉化效率,而且可以省略繁瑣的原生質體制備與再生過程,操作更為簡單。ATMT轉化體系的建立為下一步的F.solani功能基因研究奠定了基礎。
　　 4.腐皮鐮孢菌CSN1超表達菌株和表達下調菌株的構建
　　 以質粒pCAMBIA1300為骨架,以勾巢曲霉(Aspergillus nidulans)強組成型啟動子gpdA和終止子trpc,構建帶有CSN1表達原件

14、的雙元載體pCHO。通過ATMT技術將pCHO轉入F.solani0114基因組中,構建超表達CSN1的腐皮鐮孢菌。挑取12個陽性克隆進行產酶培養(yǎng)實驗,結果表明有5個克隆的殼聚糖酶體積酶活明顯增加,最高為出發(fā)菌株的2.1倍。
　　 根據(jù)CSN1 cDNA序列,對其mRNA二級結構進行軟件分析,設計出兩個能自我配對形成帶有544bp莖和229nt環(huán)結構的發(fā)夾片段。以CSN1 cDNA為模板,PCR擴增得到兩個片段,將兩個片段反向連

15、接,形成反向重復序列(IR)。以質粒pCAMBIA1300為骨架,構建帶有IR轉錄原件的雙元載體pCIR,通過ATMT技術將pCIR轉入F.solani0114基因組中,構建得到CSN1的RNA干擾(RNAi)菌株。利用平板透明圈法挑選到5株CSN1表達下調的菌株,Northernblot分析表明5株RNAi轉化子胞內的CSN1 mRNA量與出發(fā)菌株相比明顯降低。
　　 5.腐皮鑲孢菌殼聚糖酶生理功能研究
　　 利用實時

16、熒光定量RT-PCR技術(qRT-PCR)檢測到F.solani0114在液體培養(yǎng)時,CSN1主要在集中在菌體生長的延滯期表達,同時檢測到CSN1在F.solani0114對豌豆不同組織的侵染過程中也有明顯表達。表明殼聚糖酶可能不參與菌體的生長過程,而與其致病性有關。對CSN1超表達菌株和RNAi菌株的生長狀態(tài),致病能力進行了測定。結果顯示,與野生型菌株相比,CSN1超表達菌株在平板和液體培養(yǎng)時的生長都受到了明顯的抑制,而RNAi菌株的

17、生長較野生型無明顯變化。對三種菌進行豆莢侵染測試,結果顯示:與野生型菌株相比,RNAi干涉菌株的侵染能力有明顯提高(>50％)；而CSN1超表達菌株的侵染能力明顯下降(<40％)。同時,豆苗侵染測試結果也顯示RNAi菌株的毒性最高,野生型其次,CSN1超表達菌株的毒性最低,表明CSNl對F.solani的致病性有抑制作用。雖然CSN1對F.solani致病性的抑制機理有待于進一步的研究,但關于該酶的生理功能是首次報導,對于真菌殼聚糖酶的