模板調(diào)控下納米礦化骨材料的形成及其對(duì)rMSC行為的影響.pdf

1、天然骨是由膠原蛋白為主的有機(jī)相和低結(jié)晶度的羥基磷灰石為主的無(wú)機(jī)相構(gòu)成的復(fù)合礦物質(zhì)，具有精妙的分級(jí)組織結(jié)構(gòu)。骨的形成過(guò)程，是在自然生物礦化環(huán)境下，通過(guò)納米級(jí)的HA晶體沿著膠原纖維取向生長(zhǎng)，并逐級(jí)組裝成為有序、定向成核生長(zhǎng)的礦化膠原纖維。這種有機(jī)物介導(dǎo)的分子自組裝，能有效控制并調(diào)節(jié)生物材料的微觀結(jié)構(gòu)與形貌。近年來(lái)，利用蛋白模板誘導(dǎo)礦化和協(xié)同自組裝技術(shù)，構(gòu)建新型納米骨組織醫(yī)用支架是一個(gè)新趨勢(shì)。隨著近代結(jié)晶工程的發(fā)展，根據(jù)生物礦化的原理，已經(jīng)有

2、多種有機(jī)物被廣泛用作于晶體生長(zhǎng)調(diào)控劑，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)無(wú)機(jī)物成核、生長(zhǎng)和結(jié)晶產(chǎn)物尺寸和形貌的可控性合成。
　　目前，基于骨修復(fù)材料的自組裝和生物礦化已經(jīng)有許多研究，很多蛋白質(zhì)及大分子例如I型膠原、重組膠原、絲素蛋白、海藻酸鹽、牙釉質(zhì)蛋白1、兩性肽分子等，均被用作模板以介導(dǎo)和調(diào)控?zé)o機(jī)晶體的生長(zhǎng)。然而，自然界中的礦化過(guò)程不應(yīng)僅是單一模板介導(dǎo)調(diào)控的結(jié)果，許多生物分子也參與了這個(gè)調(diào)控過(guò)程，扮演重要角色。
　　因此，本課題設(shè)計(jì)合成了一種新型

3、的嵌合體復(fù)合蛋白模板，它兼具促進(jìn)和抑制HA晶體成核、生長(zhǎng)的特點(diǎn)。首先，將具有誘導(dǎo)HA晶體成核生長(zhǎng)的絲素蛋白（SF），經(jīng)化學(xué)反應(yīng)接入可抑制礦化結(jié)晶球形白蛋白（ALB），形成嵌合體復(fù)合模板，然后通過(guò)單模板和復(fù)合模板的選擇，控制誘導(dǎo)合成不同形貌的HA礦化納米顆粒。通過(guò)對(duì)蛋白模板的Zeta電位和圓二色譜法（CD）表征，可以確定了這種復(fù)合模板蛋白的結(jié)構(gòu)。通過(guò)分析得出 ALB-SF嵌合模板由于其二級(jí)結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域的改變，從而影響蛋白質(zhì)作為模板下的

4、晶體定向成核、生長(zhǎng)。隨后，對(duì)模板誘導(dǎo)下礦化合成的納米顆粒進(jìn)行了XRD、FTIR、SEM、TEM、HR-TEM和TGA的表征分析。結(jié)果表明仿生礦化合成的無(wú)機(jī)相主要表現(xiàn)為羥基磷灰石，尺寸處于納米級(jí)別，且晶體處于弱結(jié)晶性狀態(tài)。SF單模板下誘導(dǎo)合成的HA呈棒狀，沿著蛋白模板C軸方向定向生長(zhǎng)；相應(yīng)的，ALB-SF復(fù)合模板下合成的HA成球狀，結(jié)晶程度很低，且沿著蛋白模板C軸方向串成鏈珠狀。
　　納米顆粒與細(xì)胞間的相容性以及對(duì)其行為、功能的影響

5、已被廣泛研究。目前，大多數(shù)相關(guān)研究關(guān)注的重點(diǎn)都在顆粒的尺寸，以及表面化學(xué)基團(tuán)對(duì)體內(nèi)或體外組織特異性細(xì)胞的生物活性影響，而顆粒的納米形貌對(duì)細(xì)胞行為調(diào)控的方向鮮有被關(guān)注。同時(shí)，仿生礦化形成的不同形貌的羥基磷灰石納米顆粒，還未被用于干細(xì)胞行為影響的研究。因此，本課題使用大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（rMSC）作為納米顆粒形貌影響的研究對(duì)象，通過(guò)一系列對(duì)細(xì)胞粘附、遷移、增殖的檢測(cè)，比較和分析不同形貌下的礦化納米顆粒對(duì)細(xì)胞行為的調(diào)控。此外，在本研究中還首

6、次將礦化顆粒進(jìn)行熒光標(biāo)記，通過(guò)共聚焦激光電鏡和透射電鏡觀察顆粒在干細(xì)胞表面的聚集情況，以及通過(guò)胞吞作用穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)并參與細(xì)胞內(nèi)化和正常生長(zhǎng)代謝途徑的過(guò)程和程度，以此深入分析細(xì)胞與材料間的相互作用，從而直接反映干細(xì)胞對(duì)不同形貌的HA納米顆粒的響應(yīng)。
　　此外，還研究了兩種不同晶體形貌的礦化納米顆粒對(duì) rMSC向成骨方向分化的影響。通過(guò)將 rMSC分別與這兩種礦化納米顆粒在分化培養(yǎng)基的誘導(dǎo)下共培養(yǎng)，研究不同形貌的顆粒攝取、內(nèi)化對(duì)

7、成骨誘導(dǎo)能力的影響。從一系列定性和定量的實(shí)驗(yàn)，分析成骨分化早中晚期標(biāo)志性表達(dá)的堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(OCN)、骨橋蛋白(OPN)、骨粘素(ONN)、I型膠原(COL I)以及鈣結(jié)節(jié)等水平，表明兩種礦化納米顆?？纱龠M(jìn)rMSC成骨分化形成及體外礦化的產(chǎn)生，且實(shí)驗(yàn)證明ALB-SF/HA組的促進(jìn)上調(diào)趨勢(shì)更為明顯。接著，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)估了該礦化納米材料的體內(nèi)相容性和促骨修復(fù)能力。皮下植入實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，材料具有良好的生物相容性和降解性，并