卵黃高磷蛋白調(diào)控骨礦化的功能研究.pdf

1、近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)磷酸化蛋白質(zhì)在生物礦化過(guò)程中起著重要的作用，而卵黃高磷蛋白(PV)是目前自然界中磷酸化程度最高的蛋白質(zhì)之一，已有部分研究證明了卵黃高磷蛋白具有礦化調(diào)節(jié)作用，但關(guān)于它調(diào)控礦化的活性位點(diǎn)及具體機(jī)制還不明確。本課題以卵黃高磷蛋白調(diào)控骨礦化的功能為核心，構(gòu)建了不同的體外礦化模型，發(fā)現(xiàn)了卵黃高磷蛋白體外促進(jìn)礦化的現(xiàn)象并探討了其調(diào)控礦化的機(jī)制。
　　首先構(gòu)建靜電紡絲膠原蛋白膜仿生溶液礦化體系，并研究卵黃高磷蛋白在此體系中的作用及

2、調(diào)控機(jī)制;其次采用MC3T3-E1成骨細(xì)胞模型研究卵黃高磷蛋白磷酸化程度對(duì)成骨細(xì)胞礦化功能的影響及其機(jī)制;最后構(gòu)建RAW264.7破骨細(xì)胞模型，研究卵黃高磷蛋白對(duì)破骨細(xì)胞活性和功能的影響。綜合三種不同的礦化體系研究卵黃高磷蛋白的礦化功能，對(duì)其礦化機(jī)制的闡釋及應(yīng)用做相應(yīng)的理論支撐。
　　建立了基于十倍模擬體液和電紡膠原纖維膜的體外礦化模型。探討了各種礦化條件對(duì)羥基磷灰石成核和生長(zhǎng)的影響。優(yōu)化了礦化方式，礦化液的量，礦化液pH值，礦化

3、過(guò)程和礦化時(shí)間等。掃描電鏡結(jié)果顯示，在動(dòng)態(tài)礦化模式下，于pH5.7的十倍模擬體液下礦化3小時(shí)，納米纖維膜表面能產(chǎn)生結(jié)晶均勻和晶形良好的無(wú)機(jī)礦物層，該礦物質(zhì)經(jīng)FTIR和XRD鑒定為羥基磷灰石，該晶體在電紡膠原纖維膜表面和內(nèi)部均有分布。
　　探討了PV和牛血清蛋白(BSA)作為非膠原蛋白質(zhì)(NCPs)對(duì)電紡膠原纖維膜礦化體系的調(diào)控作用。通過(guò)SEM觀察PV，BSA調(diào)控下紡絲界面上礦物的形貌，形成部位，跟蹤礦化物相變及晶體形成的時(shí)間。采用

4、EDS、XRD、XPS等分析礦化物的化學(xué)組成、晶體結(jié)構(gòu)，闡明PV，BSA在紡絲界面上調(diào)控磷酸鈣礦物形成的效果和機(jī)制。該體系被證明是促進(jìn)骨樣磷酸鈣涂層形成的快速有效的方法，即通過(guò)引入PV和BSA構(gòu)建了一個(gè)良好有序的仿生礦化礦化體系:礦化過(guò)程中10×SBF中PV或BSA的存在均顯著促進(jìn)了電紡膠原纖維礦化體系中DCPD向HA轉(zhuǎn)化，且PV比BSA更加快速地促進(jìn)了礦化物相變過(guò)程。PV結(jié)合或吸附在礦物上，通過(guò)靜電相互作用提高微觀環(huán)境下Ca2+的濃度

5、，從而促進(jìn)礦化，HPLC跟蹤不同時(shí)間溶液中PV含量，結(jié)果表明在礦化物相變后期，PV復(fù)溶至礦化溶液中。
　　探索了不同磷酸化程度的PV對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖、分化和礦化的影響以及可能的作用機(jī)制。首先制備了不同脫磷酸化程度的卵黃高磷蛋白，其脫磷率分別22.67％、45.86％、59.24％、75.13％。然后分別通過(guò)CCK-8法和堿性磷酸酶測(cè)定法分析磷酸化程度對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖和分化的影響;使用茜素紅染色表征PV磷酸化程

6、度對(duì)成骨細(xì)胞礦化的影響;通過(guò)RT-PCR分析MC3T3-E1細(xì)胞系中BMP-2，RANKL和OPG mRNA的表達(dá)。結(jié)果表明卵黃高磷蛋白的磷酸化是促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞增殖、分化、礦化的關(guān)鍵因素。即高磷酸化程度的PV（脫磷酸化度＜45％）組的增殖活力，ALP活性、礦化節(jié)點(diǎn)數(shù)、BMP-2 mRNA、OPG/RANKLmRNA的比值較對(duì)照組均有顯著性增加(P＜0.05)，且呈磷酸化程度依賴性，100μg/mL PV處理組的效果最好，而最大

7、脫磷率的PV組，效果等于或明顯低于對(duì)照組。
　　研究了不同濃度PV(0、50、100、200和500μg/mL)對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖、周期、凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)低濃度PV對(duì)RAW264.7細(xì)胞有促進(jìn)增殖和抑制其凋亡的作用，100μg/mLPV時(shí)效果最好。CCK-8法表征增殖活力，發(fā)現(xiàn)100μg/mLPV濃度時(shí)增殖活力高出對(duì)照組64％-76％。通過(guò)分析PV作用24h、48h后對(duì)細(xì)胞周期的影響發(fā)現(xiàn)，不同濃度的PV均對(duì)細(xì)胞增殖均有促進(jìn)

8、作用，與對(duì)照組相比低濃度PV(50、100、200μg/mL)處理細(xì)胞后S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)、增殖指數(shù)PI增加值更多。凋亡結(jié)果表明，50、100、200μg/mL PV組凋亡率都顯著低于空白對(duì)照組，500μg/mL時(shí)凋亡率高于空白組。另外，TRAP染色細(xì)胞分化形態(tài)學(xué)及TRAP活性方面，不同濃度的PV均可顯著減少破骨細(xì)胞數(shù)量，及降低TRAP活性(P＜0.05)，且呈濃度依賴性，200μg/mL為最佳抑制濃度?？傊?，PV并非通過(guò)抑制RAW264.