雞卵黃免疫球蛋白的糖基化與功能特性的機(jī)制規(guī)律研究.pdf

1、雞卵黃免疫球蛋白，簡稱IgY(chicken eggyolk immunoglobulin)。由于IgY原料易得、制備簡單、不與類風(fēng)濕因子以及哺乳動(dòng)物的補(bǔ)體發(fā)生交叉反應(yīng)，應(yīng)用十分廣泛。目前IgY的分離純化方法復(fù)雜且耗時(shí)長，性質(zhì)不穩(wěn)定，易受溫度、pH值、酶的影響。IgY免疫球蛋白的糖鏈在維持其理化性質(zhì)、抗原特性等功能中扮演著重要角色，對(duì)IgY進(jìn)行糖基化修飾不僅可以維持空間構(gòu)象、穩(wěn)定糖蛋白結(jié)構(gòu)、保護(hù)其免受某些蛋白酶裂解等方面有重要作用，而且

2、還能改變某些生物活性和抗原特性。因此對(duì)IgY蛋白質(zhì)進(jìn)行糖基化修飾，具有十分重要的意義。本論文通過建立一種高效、簡便的分離純化的方法，制備了不同種類單糖與聚糖糖基化IgY，比較糖基化修飾前后IgY的結(jié)構(gòu)與功能性的關(guān)系。研究結(jié)果如下:
　　1.建立了一種適用于工業(yè)化生產(chǎn)高效、低成本的IgY提取方法。選用五種多糖（果膠、卡拉膠、羧甲基纖維素、甲基纖維素、硫酸葡聚糖）和五種濃度(0.01％、0.05％、0.1％、0.15％、0.2％)配制

3、的去脂液，比較了其對(duì)IgY分離效果的影響，通過SDS-PAGE、Western blots以及HPLC對(duì)IgY的提取量、純度進(jìn)行分析。果膠、硫酸葡聚糖、卡拉膠、羧甲基纖維素均在0.1％濃度時(shí)對(duì)IgY分離效果最好，提取量可分別達(dá)到8.36 mg/mL、9.31 mg/mL、7.64 mg/mL和8.1 mg/mL，純度分別達(dá)83.3％、80.1％、80.94％和79.94％，而甲基纖維素在0.15％處對(duì)IgY分離效果最好，其提取量和純度分

4、別為7.65 mg/mL，78.17％。ELISA分析表明提取的IgY均保持較高的免疫活性。綜合比較，由0.1％果膠配制的去脂液分離純化IgY的效果最好，提取量8.36mg/mL，純度83.3％。本方法能快速除去雞卵黃中的脂蛋白，操作簡單，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
　　2.選擇了四種單糖（葡萄糖、果糖、巖藻糖、甘露糖）和不同糖鏈長度的葡聚糖(5000K、20000K、40000K、70000K)，利用美拉德反應(yīng)分別對(duì)IgY進(jìn)行糖基化修飾改

5、性，對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。紫外光譜和SDS-PAGE結(jié)果表明，單糖與聚糖糖基化修飾的IgY，褐變程度均隨著糖基化時(shí)間的增加而增大。其中，四種單糖中果糖最易發(fā)生糖基化反應(yīng)，葡聚糖糖鏈長度越短，越易發(fā)生糖基化。同時(shí)，利用紅外、圓二光譜和熒光光譜監(jiān)測了糖基化IgY蛋白質(zhì)隨糖基化時(shí)間的延長二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，糖基化修飾IgY產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度下降，說明其分子周圍疏水環(huán)境發(fā)生變化。CD光譜表明糖基化后IgY的α-螺旋程度升高

6、，β-折疊下降。氨基酸分析顯示糖基化后IgY賴氨酸和精氨酸的含量明顯減少。
　　3.對(duì)單糖與聚糖基化IgY產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。DSC結(jié)果表明糖基化能明顯改善IgY的熱穩(wěn)定性。天然IgY的熱變性溫度為70.4℃，葡萄糖糖基化IgY熱變性溫度在反應(yīng)18d達(dá)到最高(79.8℃)，甘露糖糖基化IgY在24 d提高到最高(77℃)，而果糖糖基化和巖藻糖糖基化IgY在12d提高到最高，分別達(dá)到78.5℃和79℃。本文也比較了四種不同糖鏈

7、長度的葡聚糖(5000K、20000K、40000K、70000K)糖基化對(duì)IgY熱穩(wěn)定性的影響。DSC結(jié)果表明，分子量5000聚糖修飾IgY產(chǎn)物的熱變性溫度在24 d達(dá)到最高(77.3℃)，分子量20000聚糖修飾IgY產(chǎn)物在18d達(dá)到最高值(75.9℃)，分子量40000聚糖修飾IgY在18d提高最大(74.5℃)，70000聚糖修飾IgY產(chǎn)物產(chǎn)物在12d提高最大(74℃)。
　　4.對(duì)單糖與聚糖糖基化IgY產(chǎn)物的免疫活性進(jìn)行

8、了研究。ELISA結(jié)果表明，葡萄糖、甘露糖、巖藻糖、果糖IgY糖基化產(chǎn)物的免疫活性在反應(yīng)到第6天達(dá)到最高，分別比天然IgY提分別提高了30.3％、13.7％、12％、22.4％。分子量5000的IgY葡聚糖糖基化產(chǎn)物在反應(yīng)到達(dá)第24天達(dá)到最高，但比天然IgY降低14.3％，分子量20000、40000、70000的IgY葡聚糖糖基化產(chǎn)物在反應(yīng)到達(dá)第6天最高，分別降低37.4％、40.4％、44.3％。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，葡聚糖糖鏈長度越短，免疫活

9、性越高，其中G5000K＞G20000K＞G40000K＞G70000。
　　5.對(duì)單糖與聚糖糖基化IgY產(chǎn)物在模擬胃腸液中的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。ELISA結(jié)果表明，天然IgY經(jīng)過模擬胃腸液消化后活性保持率在20.1％。葡萄糖和巖藻糖糖基化IgY產(chǎn)物的免疫活性保持率均在18天達(dá)到最高，分別比天然IgY提高了201％和121％;甘露糖基化IgY產(chǎn)物在12天達(dá)到最高，比天然IgY提高了200％;果糖糖基化IgY產(chǎn)物在24天達(dá)到最高，比天