玫瑰無須鲃卵黃脂磷蛋白是具有調(diào)理素功能的免疫識(shí)別因子.pdf

1、卵黃脂磷蛋白(Lipovitcllin,Lv),是卵黃蛋白原(Vitellogenin,Vg)被卵母細(xì)胞吸收水解后的主要產(chǎn)物之一,是一種大分子糖脂蛋白。本論文以玫瑰無須鲃(Puntius conchonius)卵為材料,通過DEAE-23離子交換柱層析和Superdex 200凝膠過濾柱層析純化得到了Lv,天然聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)顯示Lv分子量約為370 kDa,變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)顯示有三

2、條帶,分子量分別為125 kDa,110 kDa和76 kDa。糖、磷、脂特異性染色實(shí)驗(yàn)表明玫瑰無須囟巴魚Lv富含糖、脂,而磷含量較少。Lv的氨基酸組成析結(jié)果顯示其與哲羅魚,虹鱒魚,以及青鳉魚Lv的氨基酸組成十分相似,質(zhì)譜分析結(jié)果表明從125 kDa和110kDa條帶所得的肽段序列與鯉魚卵黃蛋白原B1的Lv重鏈相匹配,而從76 kDa條帶所得的肽段序列與鯉魚卵黃蛋白原B1的Lv輕鏈相匹配。由氨基酸組成分析和質(zhì)譜鑒定結(jié)果可以鑒定通過雙步層

3、析法純化得到的蛋白確實(shí)為玫瑰無須鲃卵黃脂磷蛋白。用純化的玫瑰無須魚巴Lv免疫新西蘭大白兔得到多克隆抗血清,用抗血清作蛋白免疫印跡(Western blotting)發(fā)現(xiàn)Lv具有明顯的性別特異性,而且利用抗Lv血清可以檢測雌性玫瑰無須鲃血漿中的Vg,利用免疫雙擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)Lv具有組織特異性。
　　 Lv一直被認(rèn)為是卵子發(fā)生和胚胎發(fā)育過程中的主要營養(yǎng)物質(zhì),但是其它方面的功能研究較少。魚類發(fā)育成熟的卵細(xì)胞排到水中與精子結(jié)合形成受精卵

4、,屬于體外受精,胚胎和幼體發(fā)育都在水中進(jìn)行,但是水中存在很多魚類致病菌和病毒,這對于免疫系統(tǒng)還沒有發(fā)育完善的胚胎和幼魚來說是很大的威脅,本論文通過實(shí)驗(yàn)證明了Lv在胚胎和幼體發(fā)育階段還發(fā)揮了抵御病原菌侵襲的作用,是一種具有調(diào)理素作用的免疫識(shí)別因子。將異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的Lv與大腸桿菌(Ecold和葡萄球菌(S.aureus)孵育后熒光顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)E.coli和S.aureus均能發(fā)綠色熒光;卵勻漿液和Lv溶液分別與大腸桿菌

5、和金黃色葡萄球菌孵育,然后洗滌去除未結(jié)合的蛋白,最后用4M尿素洗脫結(jié)合在細(xì)菌表面的蛋白做Western blotting分析,結(jié)果在卵勻漿液和Lv溶液與兩種細(xì)菌作用后的洗出液中,都能檢測到Lv,上述兩個(gè)實(shí)驗(yàn)證明Lv與大腸桿菌和葡萄球菌都能結(jié)合。為了更好的理解卵黃脂磷蛋白與細(xì)菌的結(jié)合機(jī)制,又做了酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)來調(diào)查細(xì)菌表面的哪些分子被卵黃脂磷蛋白所識(shí)別。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Lv能夠識(shí)別非己成分,與病原相關(guān)模式分子(PAMPs),包括脂多糖(l

6、ipopolysaccharide,LPS)、脂磷壁酸(lipoteichoic acid,LTA)、肽聚糖(peptidoglycan,PGN)等發(fā)生特異性結(jié)合,并且結(jié)合呈現(xiàn)濃度依賴性。上述結(jié)果表明Lv是一種多價(jià)的模式識(shí)別受體。本論文還通過巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌實(shí)驗(yàn)研究了Lv對巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌作用的影響。通過定義兩個(gè)參數(shù)來判斷巨噬細(xì)胞的吞噬情況,一個(gè)為吞噬能力(phagocytic ability,PA),即吞噬了細(xì)菌的巨噬細(xì)胞個(gè)數(shù)占所有統(tǒng)