大竹蟶肽聚糖識別蛋白的免疫防御功能研究.pdf

1、大竹蟶（Solen grandis）屬瓣鰓綱，廣泛分布于中國沿海各地。因其個體大、出肉率高、味道鮮美、營養(yǎng)豐富和經(jīng)濟價值高，大竹蟶已成為我國重要的海洋經(jīng)濟品種之一。與其它海洋無脊椎動物相似，大竹蟶缺乏獲得性免疫系統(tǒng)，主要依靠先天性免疫系統(tǒng)抵御外界病原微生物的侵害。
　　肽聚糖識別蛋白是無脊椎動物先天性免疫中重要的模式識別受體，能夠識別細菌的肽聚糖，在病原識別和清除過程中發(fā)揮重要作用。到目前為止，對大竹蟶肽聚糖識別蛋白的研究非常有限

2、，其抵御外來病原入侵的作用機制尚不清楚。本研究結合分子生物學和免疫生物學的實驗方法和技術，對大竹蟶肽聚糖識別蛋白介導的免疫識別和免疫應答進行研究，旨在深入了解大竹蟶的先天性免疫機制。
　　(一)序列分析
　　本研究獲得了大竹蟶肽聚糖識別蛋白 SgPGRP-S1和SgPGRP-S2編碼基因的cDNA，其全長分別為1672和1285 bp，各自編碼270和141個氨基酸。ExPASy預測兩個蛋白基因的理論等電點分別為7.82和5

3、.46，分子量分別為28.4和14.7 kDa。
　　同源性分析顯示SgPGRP-S1與SgPGRP-S2之間的相似度為51％，二者分別與光滑雙臍螺（ABO40829）和囊舌蟲（XP_002734591）的肽聚糖識別蛋白同源性最高，相似度分別為57%和55%。
　　多序列比對發(fā)現(xiàn)，SgPGRP-S1和SgPGRP-S2序列中均存在高度保守的Zn2+結合位點和酰胺酶催化位點，Zn2+結合位點分別為H135、H244和C252以

4、及H115和C123，酰胺酶催化位點分別為H135，Y170，H244，T250和C252以及H115、T121和C123。
　　構建系統(tǒng)進化樹探討SgPGRP-S1和SgPGRP-S2與其它生物（牡蠣、櫛孔扇貝、海灣扇貝、果蠅和人）的進化關系，發(fā)現(xiàn)SgPGRP-S1和SgPGRP-S2與軟體動物具有較高的同源性，與牡蠣的四種肽聚糖識別蛋白-S1S、-S1L、-S2，-S3聚合成支。
　　以上結果證明SgPGRP-S1和Sg

5、PGRP-S2是肽聚糖識別蛋白超家族的重要成員。
　　(二)熒光定量PCR檢測SgPGRP的轉錄規(guī)律
　　利用熒光定量PCR法檢測了SgPGRP-S1和SgPGRP-S2在健康大竹蟶組織中的轉錄規(guī)律，發(fā)現(xiàn)二者在所有檢測組織中都有表達。SgPGRP-S1在肌肉和肝胰腺中的表達量最高，其次為鰓、外套膜、性腺，在血細胞中的表達量最低；SgPGRP-S2在鰓和外套膜中表達量較高，其次為血細胞和性腺，在肌肉中表達量最低。
　　此

6、外，通過熒光定量PCR分析檢測LPS、PGN和glucan刺激后SgPGRP-S1在血細胞中的表達規(guī)律。經(jīng)PGN刺激后，SgPGRP-S1的表達量在3 h顯著升高為對照的14.3倍；在6 h達到最高，為對照組的7471倍；在12 h和48 h分別降低為對照組的13.9和5.7倍。經(jīng)glucan刺激后，SgPGRP-S1的表達量在12、24和48 h分別顯著升高為對照組的22.4、11.9和89.7倍。而在LPS刺激后，SgPGRP-S1

7、的表達量較對照組沒有顯著升高。
　　與SgPGRP-S1相比，SgPGRP-S2的表達量在LPS刺激后升高顯著，在6 h升高為對照組的4.1倍，在24 h和48 h又顯著下調為0.1和0.3倍。經(jīng)PGN刺激后，SgPGRP-S2的表達趨勢與SgPGRP-S1相似，在6 h達到高，在12 h略降低后，24 h升高為對照的4.4倍。在glucan刺激組，SgPGRP-S2的表達量在12 h顯著升高為對照組的23.1倍，隨后恢復到原始水

8、平。
　　(三) rSgPGRP-S1活性分析
　　PAMPs結合實驗表明，SgPGRP-S1重組蛋白（rSgPGRP-S1）可以體外結合 PGN，其結合能力隨其濃度增大而增強。rSgPGRP-S1對LPS和β-glucan均無結合能力。這些結果表明SgPGRP-S1主要介導大竹蟶對PGN的免疫識別作用。
　　rSgPGRP-S1具有廣譜凝菌活性，對大腸桿菌和鰻弧菌等革蘭氏陰性菌以及藤黃微球菌等革蘭氏陽性菌有凝集活性。

9、該結果初步揭示了SgPGRP-S1作為模式識別受體，參與大竹蟶對抵御入侵病原微生物的免疫識別和免疫應答反應。
　　進一步研究rSgPGRP-S1的酰胺酶活性，發(fā)現(xiàn)其具有依賴Zn2+的酰胺酶活性，通過水解N-乙酰胞壁酸和L-丙氨酸之間的肽鍵而降解不溶性PGN。使用平板擴散法檢測rSgPGRP-S1對革蘭氏陰性大腸桿菌和革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌的抑制活性，發(fā)現(xiàn)存在 Zn2+時，rSgPGRP-S1對兩種細菌均具有顯著的抑制活性，產生明

10、顯的抑菌圈。
　　同時檢測rSgPGRP-S1對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生長曲線的影響，發(fā)現(xiàn) Zn2+存在時，rSgPGRP-S1在細菌生長對數(shù)期能夠明顯抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長，而在生長穩(wěn)定期表現(xiàn)出顯著的殺菌活性。rSgPGRP-S1的這種抑菌殺菌活性可能與其酰胺酶活性有關。
　　綜上所述，本論文研究了大竹蟶肽聚糖識別蛋白作為模式識別受體，介導對 PAMPs和病原微生物等的免疫識別作用和抵御病原微生物入侵等免疫應