神經(jīng)退行性疾病相關(guān)蛋白的翻譯后修飾對(duì)蛋白功能影響的研究.pdf

1、神經(jīng)退行性疾病是一類由腦中特定區(qū)域神經(jīng)元發(fā)生退變而引起的慢性進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，通?？煞譃榧易暹z傳型和散發(fā)型，在家族遺傳型中，主要由于致病基因的突變而引起發(fā)病。大部分神經(jīng)退行性疾病的一個(gè)共同的病理特征是致病蛋白會(huì)由于降解異常而在胞質(zhì)、胞核或者胞外形成異常的積聚而形成聚集。約有20％的家族遺傳型肌肉萎縮側(cè)索硬化癥(FALS)是由于編碼銅-鋅過(guò)氧化物歧化酶(SOD1)的基因發(fā)生突變而引起的，從而造成腦和脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的選擇性喪失引起發(fā)病。突

2、變的SOD1通常在發(fā)病患者的腦和脊髓中通過(guò)聚集而形成包涵體，但其致病機(jī)制以及突變蛋白的聚集機(jī)制至今尚未能明確闡述。另一種神經(jīng)退行性疾病脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)Ⅲ型(SCA3)/馬查多-約瑟夫病(MJD)是由于編碼谷氨酰胺的密碼子CAG的數(shù)量在MJD1基因中非正常擴(kuò)增而引起的一種常染色體顯性遺傳的多聚谷氨酰胺病。該病的主要病理特征為突變的ataxin-3(MJD1編碼蛋白)在患者易感腦區(qū)內(nèi)的神經(jīng)元胞核內(nèi)聚集形成包涵體，但其聚集機(jī)制以及致病機(jī)制至今

3、也不清楚。 神經(jīng)退行性疾病中聚集的形成與這些致病蛋白的翻譯后修飾作用有很大的關(guān)系。蛋白質(zhì)的翻譯后修飾包括磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化和SUMO化等，它們可以通過(guò)調(diào)節(jié)底物蛋白的活性、亞細(xì)胞器定位、穩(wěn)定性或者與其它蛋白質(zhì)的相互作用而達(dá)到調(diào)節(jié)蛋白功能的作用。很多神經(jīng)退行性疾病相關(guān)蛋白如huntingtin、ataxin-1、α-synuclein、DJ-1和tau等由于SUMO化修飾而對(duì)蛋白功能以及疾病發(fā)病過(guò)程產(chǎn)生影響，也有很多研

4、究表明多聚谷氨酰胺疾病蛋白如huntingtin，ataxin-1和DRPLA的磷酸化對(duì)于蛋白的功能以及疾病發(fā)生有很重要的影響。因此，蛋白質(zhì)的翻譯后修飾作用與神經(jīng)退行性疾病之間存在著很大的聯(lián)系。 本論文主要從家族型肌萎縮側(cè)索硬化癥(FALS)的致病蛋白SOD1的SUMO化和脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)Ⅲ型(SCA3)/馬查多-約瑟夫病(MJD)致病蛋白ataxin-3的磷酸化這兩方面來(lái)探討蛋白質(zhì)翻譯后修飾對(duì)這些神經(jīng)退行性疾病致病蛋白特性的

5、影響，主要研究結(jié)果如下： 1.我們運(yùn)用免疫共沉淀方法和體外SUMO化反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)SOD1能夠被SUMO-1修飾，但是卻不能被SUMO-2和SUMO-3修飾。將SOD1中第75位賴氨酸這個(gè)保守的SUMO修飾位點(diǎn)突變?yōu)榫彼岷?，SOD1則完全不能夠被SUMO-1修飾。通過(guò)進(jìn)一步的細(xì)胞共轉(zhuǎn)染技術(shù)，并用熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)經(jīng)SUMO-1修飾后，野生型和突變型SOD1所形成的胞漿內(nèi)聚集均會(huì)增加，而且SUMO-1能夠被招募至SOD1所形成的聚

6、集上，與SOD1在細(xì)胞內(nèi)聚集體上有共定位現(xiàn)象。更進(jìn)一步通過(guò)加入放線菌酮(CHX)以抑制新生蛋白的合成來(lái)檢測(cè)已合成蛋白的降解速度，證實(shí)DUMO-1可以穩(wěn)定野生型和突變型SOD1而不易降解。這些結(jié)果提示，SUMO-1對(duì)SOD1在第75位賴氨酸的修飾可能參與調(diào)控SOD1的穩(wěn)定性以及聚集的形成，進(jìn)而可能對(duì)出SOD1突變所引起的FALS的發(fā)病產(chǎn)生影響。 2.我們運(yùn)用GST Pull-down和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)激酶GSK 3β與ataxin-3能

7、夠結(jié)合，并且通過(guò)γ-<'32>p標(biāo)記的ATP進(jìn)行體外磷酸化實(shí)驗(yàn)證明正常和擴(kuò)展的ataxin-3均能被激酶GSK 3β磷酸化。通過(guò)磷酸化位點(diǎn)的點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)磷酸化的位點(diǎn)是在ataxin-3的第256位絲氨酸上。我們進(jìn)一步構(gòu)建了第256位絲氨酸喪失磷酸化的突變體S256A以及模擬磷酸化的突變體S256D，采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染和免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)展的ataxin-3的S256A突變體會(huì)形成高分子量的多聚體形成聚集，麗沒(méi)有突變的擴(kuò)展的ataxi

8、n-3和其S256D突變體則只是單體。更進(jìn)一步與分子伴侶Hsp40或Hsp70分別共轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)，Hsp70能夠抑制擴(kuò)展的ataxin-3的S256A突變體形成聚集。這些結(jié)果表明激酶GSK3β對(duì)ataxin-3第256位絲氨酸的磷酸化能夠調(diào)節(jié)ataxin-3的聚集，該特性可能對(duì)SCA3/MJD的發(fā)病產(chǎn)生影響。 通過(guò)以上兩個(gè)方面的研究結(jié)果可以看出，蛋白質(zhì)翻譯后修飾作用能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)退行性疾病致病蛋白的特性，影響蛋自的聚集，從而可能對(duì)