長柄鏈格孢菌(Alternaria longipes)AlSte7的基因克隆及功能研究.pdf

1、促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是一類廣泛存在于真核生物中信號途徑，在許多生命活動中扮演重要角色，幾乎涉及所有的生理及病理過程。同樣真菌的生長發(fā)育等生命過程也受其調(diào)控，研究表明MAPK途徑在真菌的致病性、形態(tài)建成和應(yīng)激反應(yīng)等方面起著重要的作用。
　　 本研究以長柄鏈格孢(Alternarialongipes)為研究對象，成功的克隆了A.longipe

2、s的一個MAPKK基因-AlSte7，并構(gòu)建了基因插入突變載體，利用聚乙二醇介導(dǎo)的方法，對A.longipes的原生質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步通過PCR方法，篩選并驗證得到了AlSte7基因插入突變體，通過和野生菌的比對研究，分析了AlSte7基因的功能。
　　 利用Ste7同源基因的保守序列設(shè)計簡并寡核苷酸引物，結(jié)合RT-PCR和Tail-PCR技術(shù)從A.longipes中克隆得到了MAPKKAlSte7基因；該基因全長cDNA13

3、56bp，DNA1513bp，含有三個內(nèi)含子，均符合GT-AC法則；運用生物信息學(xué)軟件對AlSte7基因進(jìn)行堿基組成和氨基酸組成特征以及一級，二級結(jié)構(gòu)等方面進(jìn)行了分析，并與來源于其它真菌的Ste7同源基因進(jìn)行了同源性比較。
　　 利用構(gòu)建的AlSte7基因插入突變載體pCB1636-AlSte7以及M13F/M13R引物擴增重組質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物對A.longipes原生質(zhì)體進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，采用PCR方法篩并驗證得到了AlSte7基因

4、插入突變體。對AlSte7基因插入突變體和野生菌進(jìn)行了比較研究，結(jié)果顯示AlSte7基因插入突變體在PDA上生長的速度明顯下降，約下降32～48％左右，且PDB培養(yǎng)后測干重轉(zhuǎn)化子較野生菌的有所降低；AlSte7基因插入突變體也不能產(chǎn)生完全分化的孢子；人工接種未刺傷煙草老齡葉片，AlSte7基因插入突變體基本不能侵染煙草葉片，形成危害癥狀。而人為刺傷煙草葉片后，AlSte7基因插入突變體能侵染葉片，造成明顯的癥狀，說明AlSte7基因插入