鏈格孢霉變應(yīng)原的實驗研究.pdf

1、本文對鏈格孢霉的培養(yǎng)、鑒定、提取、分析以及浸出液的2-DE指紋圖譜進(jìn)行了研究。全文分為五部分： 第一部分：鏈格孢霉過敏的臨床特征及標(biāo)準(zhǔn)血清池的建立我們對2005年8月至2007年5月期間收集到的55例鏈格孢霉過敏者進(jìn)行了臨床分析，其年齡從6歲至75歲不等，平均為34±17歲，男性為29例，女性為26例。55例中有43例(78.2％)為支氣管哮喘，30例(54.5％)為過敏性鼻炎，18例(33％)為過敏性鼻炎合并有支氣管哮喘，這些

2、患者的發(fā)病季節(jié)多為夏季。 為了進(jìn)行鏈格孢霉致敏蛋白的分析，從上述55例中選擇了20例患者，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)血清池。 第二部分：鏈格孢霉菌種的收集、培養(yǎng)和鑒定本實驗的鏈格孢霉是從空氣曝皿中收獲的菌種，然后進(jìn)行提純培養(yǎng)，對于后者應(yīng)用常規(guī)的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定。 形態(tài)學(xué)鑒定顯示所培養(yǎng)的真菌生長7d后，呈灰黑色至黑色，分生孢子呈倒棒形或卵形。 分子生物學(xué)鑒定：為了提高鏈格孢霉浸出液的制備水平，在必要時需采用分子生物學(xué)的

3、辦法進(jìn)行鑒定；本研究應(yīng)用PCR對所培養(yǎng)真菌的26S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增后，通過Genebarlk進(jìn)行比對，與鏈格孢霉相似性達(dá)99％以上。 通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的鑒定，證明它與鏈格孢霉有高度一致性。其拉丁文為alternaria alternata Keissler，其標(biāo)準(zhǔn)中文名為鏈格孢霉或交鏈格孢或互隔鏈格孢；本文統(tǒng)一采用鏈格孢霉。 第三部分：鏈格孢霉變應(yīng)原提取方法的研究為了探索最有效的鏈格孢霉變應(yīng)原的提取方法，對新鮮培

4、養(yǎng)的鏈格孢霉菌苔按4種不同的方法進(jìn)行提取，分別為研磨器研磨、液氮研磨、研磨器研磨＆超聲破碎、液氮研磨＆超聲破碎(LNU)；對所得到的4種浸液應(yīng)用Bradford法及SDS-PAGE進(jìn)行分析，并用RAST抑制試驗測定變應(yīng)原活性。結(jié)果顯示：不同提取方法提取新鮮培養(yǎng)的鏈格孢霉菌苔，經(jīng)LNU所得到的變應(yīng)原浸液，蛋白質(zhì)含量最高、蛋白條帶最多，在RAST抑制試驗中達(dá)到50％抑制所需蛋白含量是最低的。據(jù)此我們認(rèn)為在對于鏈格孢霉來說，LNU是較好的提取

5、方法。 第四部分：SDS-PAGE免疫印跡分析為了明確鏈格孢霉變應(yīng)原浸液的致敏蛋白，本實驗通過對LNU法提取的鏈格孢霉變應(yīng)原浸液進(jìn)行免疫印跡分析。 研究結(jié)果顯示：經(jīng)SDS-PAGE免疫印跡分析顯示，有7條蛋白條帶能與鏈格孢霉特異性IgE結(jié)合，分子量分別為92KD、87KD、67KD、53KD、45KD、29KD、22KD；7種致敏蛋白中，有3種主要致敏蛋白，這些蛋白能被一半以上的病人血清所識別，它們的分子量分別為92KD