柑橘中5種鏈格孢霉毒素檢測技術(shù)及產(chǎn)生分布規(guī)律初探.pdf

1、鏈格孢霉毒素是由鏈格孢菌屬產(chǎn)生的一類具有誘變性、基因毒性、致癌致畸毒性及急性毒性等毒性的次級代謝產(chǎn)物，其中主要的代謝產(chǎn)物有鏈格孢酚（AOH）、交鏈格孢酚單甲醚（AME）、交鏈孢烯（ALT）、鏈格孢菌毒素I，II，III（ATX-I，ATX-II，ATX-III）、細交鏈格孢菌酮酸（TeA）和騰毒素（Ten）等。柑橘是世界上最重要的農(nóng)產(chǎn)品和經(jīng)濟作物之一。我國柑橘的種植面積和年產(chǎn)量目前均居世界首位。柑橘在生長、采收、貯藏、運輸和銷售等各個過

2、程，均易受到霉菌污染繼而產(chǎn)生并積累展青霉素、鏈格孢霉毒素等各種真菌毒素，對柑橘鮮果食用和柑橘類果汁加工以及柑橘皮渣利用等都存在重大的安全隱患，嚴重影響柑橘及其加工制品、副產(chǎn)品的安全食用，危害消費者的生命和健康。近兩年鏈格孢菌等引起柑橘褐斑病、黑腐病等嚴重病害及鏈格孢霉毒素對柑橘食用安全產(chǎn)生的危害引起各國研究者的熱切關(guān)注，但目前國內(nèi)外仍沒有鏈格孢霉毒素相關(guān)的限量標準和系統(tǒng)研究，因此研究柑橘中的鏈格孢霉毒素對其限量標準的制定和風險評估等方面

3、都具有重要的科學意義和現(xiàn)實意義。
　　本論文研究建立了易污染柑橘的鏈格孢酚、交鏈格孢酚單甲醚、交鏈孢烯、騰毒素及細交鏈格孢菌酮酸5種鏈格孢霉毒素的QuEChERS-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜快速檢測方法，開展了重慶市柑橘中的鏈格孢霉毒素的污染情況調(diào)查及抽樣監(jiān)測分析，并以不同品種柑橘為研究對象，研究了人工純種霉菌接種后不同品種柑橘果實中5種鏈格孢霉毒素的產(chǎn)生規(guī)律和鮮果不同部位的分布情況。具體研究內(nèi)容和研究結(jié)果如下：
　　1.建立了

4、QuEChERS-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測柑橘中Ten、ALT、AOH、AME和TeA5種鏈格孢霉毒素的方法。待測樣品經(jīng)改進的QuEChERS前處理方法一步完成萃取凈化，采用乙腈（1.5％甲酸）提取，無水MgSO4和NaCl鹽析，以ACQUITY UPLC BEH C18液相色譜柱為分離柱，用乙腈和0.1%甲酸水溶液進行梯度洗脫，電噴霧正離子（ESI+）多反應(yīng)模式監(jiān)測，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）測定，外標法

5、定量。在該方法條件下，5種鏈格孢霉毒素分離效果良好，在2.0～100μg/L濃度范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系，R2>0.99，檢出限在0.11～0.91μg/kg之間。在5、20和100μg/kg三個水平下加標5種毒素的加標回收率在71%~112%范圍內(nèi)，相對標準偏差為1.08%～9.87%，能滿足柑橘中真菌毒素檢測的要求。
　　2.對重慶柑橘主產(chǎn)地區(qū)果園以及各大超市采集的不同柑橘品種共計113批次樣品中的5種鏈格孢霉毒素的污染水平開

6、展了監(jiān)測分析。其主要研究結(jié)果如下：
　?。?）5種鏈格孢霉毒素在柑橘樣品中的總檢出率為27.43%，總含量范圍在2.14～66.55μg/kg之間，檢出平均含量為12.70μg/kg；TeA、Ten和AOH的檢出率和檢出含量均比較高，其中Ten的檢出率最高，可達15.93%，TeA的檢出含量最高，可達66.55μg/kg。
　　（2）市場和基地果園兩類樣本來源均有部分柑橘樣品中能檢出各種鏈格孢霉毒素。其中市場取樣的寬皮柑橘檢

7、出率高于基地采樣，而基地采集的其他品種的柑橘的檢出率和檢出含量均高于市場取樣。
　　（3）鏈格孢霉毒素檢出平均總含量較高的是寬皮柑橘和柚類，其中5種鏈格孢霉毒素在寬皮柑橘中均有檢出，檢出率34.88%，含量范圍在2.24～66.55μg/kg之間，檢出平均總含量為11.54μg/kg。
　　3.研究了不同柑橘品種人工接種鏈格孢菌屬（Alternaria alternate）后，病斑部位全果、病斑部位之外的健康部位果皮和果肉中

8、5種鏈格孢霉毒素的產(chǎn)生變化和分布規(guī)律。結(jié)果表明：
　?。?）在接種5天時，不同柑橘品種果實發(fā)病部位中均產(chǎn)生了Ten、ALT、AME、AOH和TeA，在整個發(fā)病過程中，病變部位中TeA產(chǎn)生和累積速度最快，檢出含量最高（可達55880.71μg/kg）。不同柑橘品種經(jīng)過純種鏈格孢菌人工接種后的產(chǎn)生鏈格孢霉毒素含量的的能力不同，最終含量高低順序為：溫州蜜柑>紅橘>錦橙>檸檬>宜昌橙>葡萄柚。
　?。?）柑橘品種中發(fā)病部位（全果，包

9、括果皮和果肉）、健康部位果皮和健康部位果肉中的5種鏈格孢霉毒素含量隨著病斑直徑的擴大逐漸增加，其中在發(fā)病部位的含量范圍為0～55880.71μg/kg，在健康部位果皮的含量范圍為0～26336.65μg/kg；在健康部位果肉的含量范圍為0～40677.65μg/kg。同時也發(fā)現(xiàn)橙類和柚類的果皮抗菌能力強，寬皮柑橘抗性弱。研究表明，由于柑橘感染產(chǎn)毒鏈格孢菌后產(chǎn)生的毒素會從病斑部位擴散到周圍健康部位進而累積，因此，在鮮食加工和風險評估中應(yīng)引