兩種盔孢傘菌絲體人工培養(yǎng)及毒素檢測(cè).pdf

1、鵝膏毒肽是一類(lèi)毒性極大的毒素，其作用機(jī)理主要是抑制真核生物RNA聚合酶Ⅱ的活性，作為重要的生化試劑在醫(yī)學(xué)生物學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)等學(xué)科的研究中有廣泛的應(yīng)用。鵝膏毒肽主要存在于鵝膏屬真菌中，另外也存在于盔孢傘屬的一些種類(lèi)中，由于鵝膏菌大多為外生菌根菌，對(duì)其進(jìn)行人工培養(yǎng)很困難，因此，目前鵝膏毒肽主要提取自野生鵝膏菌子實(shí)體;因資源有限，造成鵝膏毒肽價(jià)格昂貴。盔孢傘作為腐生菌，培養(yǎng)相對(duì)容易。本論文首先對(duì)盔孢傘菌絲體進(jìn)行人工培養(yǎng)

2、，進(jìn)而對(duì)其子實(shí)體和菌絲體進(jìn)行鵝膏毒肽的檢測(cè)。
　　本文研究的盔孢傘分別采自于湖南瀏陽(yáng)縣、湖南綏寧縣、湖南保靖縣和新疆烏魯木齊。通過(guò)傳統(tǒng)的形態(tài)比較和現(xiàn)代的ITS序列比對(duì)的方法進(jìn)行菌種的鑒定，確定上述四地采集的標(biāo)本共有兩種;其中，湖南瀏陽(yáng)、綏寧、保靖所采標(biāo)本為同一種，即條蓋盔孢傘[Galerinasulciceps(Berk.) Singer]，而新疆所采標(biāo)本為紋緣盔孢傘[Galerinamarginata(Batsch) Kuhne

3、r];通過(guò)篩選，選擇采自于瀏陽(yáng)和新疆的標(biāo)本進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　本文采用孢子分離和組織分離法分離出以上兩種盔孢傘。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行菌絲體的純培養(yǎng)，并對(duì)菌絲體和子實(shí)體進(jìn)行測(cè)序，得到ITS序列，進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)兩者的菌絲體和用于分離的子實(shí)體具有完全相同的ITS序列，因此可以認(rèn)定分離所得菌絲體為對(duì)應(yīng)盔孢傘的菌種。通過(guò)培養(yǎng)基的篩選，確定最適基礎(chǔ)培養(yǎng)基，再通過(guò)單因子篩選，分別對(duì)碳源、氮源、pH、溫度進(jìn)行了篩選實(shí)驗(yàn)，分別確定兩個(gè)菌種的最適培養(yǎng)條件

4、。最后，分別提取兩種盔孢傘子實(shí)體、菌絲體以及液體培養(yǎng)發(fā)酵液的毒素，再利用HPLC進(jìn)行檢測(cè)，確定鵝膏肽類(lèi)毒素種類(lèi)和毒素含量。
　　通過(guò)固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基篩選，確定HSVA為最適基礎(chǔ)培養(yǎng)基;通過(guò)單因子篩選，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)種的最適氮源均為蛋白胨(1 g/L)+NH4CL(0.1g/L);最適碳源均為葡萄糖，但紋緣盔孢傘G.marginata對(duì)糖濃度的需求量略高;最適合菌絲體生長(zhǎng)的溫度均為20℃;均具有較廣的pH值適應(yīng)范圍。通過(guò)液體培養(yǎng)基的篩選，發(fā)

5、現(xiàn)條蓋盔孢傘G.sulciceps的最適碳源為葡萄糖，紋緣盔孢傘G.marginata的最適碳源為紅糖;且兩個(gè)種的最適pH值均為6。通過(guò)HPLC，檢測(cè)出條蓋盔孢傘G.sulciceps的子實(shí)體毒素含量為1795.3μg/g干重的α-Ama和1925.0μg/g干重的β-Ama，紋緣盔孢傘G.marginata的子實(shí)體毒素含量為445.4μg/g干重的α-鵝膏毒素(α-Ama)和527.0μg/g干重的β-鵝膏毒素（β-Ama）;對(duì)這兩種