中國被毛孢菌絲體水提物質(zhì)量分析與控制方法研究.pdf

1、本課題對(duì)冬蟲夏草無性型中國被毛孢(Hirsutella sinensis)提取物的核苷成分、含量及小分子物質(zhì)反相HPLC指紋圖譜及大分子物質(zhì)SEC—HPLC色譜圖譜指紋分析方法進(jìn)行了研究。 RP—HPLC/ESI—MS分析表明，中國被毛孢菌絲體水提物中存在胞苷、尿苷、肌苷、鳥苷和腺苷但不含有蟲草素，含量分別為：565.452±3.157，1004.056±2.418，40.957±0.400，905.858±7.073和748

2、.621±4.915(μg/g)，回收率分別為87.20±3.52％，97.46±0.80％，98.06±1.04％，87.54±1.02％，76.92±1.58％和100.50±1.42％，標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為：A=1.491E—005c—0.766，A=1.365E—005c—0.533，A=9.159E—006c—0.034，A=9.118E—006c—0.128，A=1.032E—005c—0.161，A=9.788E—006c—0.

3、038(c為對(duì)照品濃度/μg/mL，A為相應(yīng)峰面積)。提取方法研究結(jié)果表明，熱水提取比50％乙醇—水熱提和50％乙醇—水超聲提取更適合核苷提取。中國被毛孢菌絲體水提物中胞苷、尿苷、肌苷、鳥苷、腺苷和蟲草素六種核苷的相對(duì)比例為17.3:30.8:1.3:27.7:22.9:0.0，用“夾角余弦”方法計(jì)算相似度，結(jié)果與天然冬蟲夏草較相似(相似度為0.89)。RP—HPLC圖譜用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”軟件分析相似度，發(fā)現(xiàn)中國被毛孢

4、與天然冬蟲夏草的相似度最高，為0.799，超過Cordyceps sinensis CS1菌絲體、金水寶膠囊(Cordyceps sinensis CS4)、蛹蟲草(Cordyceps militaris)菌絲體和子實(shí)體與天然冬蟲夏草的相似度(分別為0.718、0.680、0.737和0.504)。因此核苷含量和RP—HPLC圖譜指紋分析可作為中國被毛孢及其產(chǎn)品中小分子物質(zhì)的質(zhì)控指標(biāo)和方法。 為建立大分子物質(zhì)的指紋分析和相似度定

5、量計(jì)算方法，首先用23個(gè)靈芝菌絲體粗多糖樣品的分子量分布凝膠滲透HPLC圖譜(SEC—HPLC)進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)可將SEC—HPLC圖譜有效分離范圍(10-23min)內(nèi)所有時(shí)間點(diǎn)的信號(hào)值為變量，采用“夾角余弦(cosθ)”法定量計(jì)算各圖譜的相似度。該相似度用“組間平均鏈鎖(Between—group linkage)”聚類法可重現(xiàn)各靈芝種及株的親緣遠(yuǎn)近關(guān)系，正確率達(dá)到87％。以此方法為模型，分析了中國被毛孢大分子物質(zhì)的SEC—HP

6、LC圖譜，并與天然冬蟲夏草及CS1菌絲體、金水寶膠囊、蛹蟲草菌絲體和子實(shí)體提取物比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)中國被毛孢大分子物質(zhì)的分子量分布與天然蟲草較接近，相似度達(dá)到0.966，除蛹蟲草子實(shí)體外(相似度0.978)，都高于CS1菌絲體、金水寶膠囊、蛹蟲草菌絲體與冬蟲夏草的相似度(分別為0.843、0.805和0.675)，結(jié)果與RP—HPLC指紋分析結(jié)果基本符合。對(duì)十種不同培養(yǎng)基及1，3，6個(gè)月不同時(shí)間獲得的菌絲體分析表明，共16個(gè)樣品的SEC—H