多發(fā)性骨軟骨瘤超微結(jié)構(gòu)的觀察及分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　多發(fā)性骨軟骨瘤(Multiple Osteochondroma，MO)屬于一種骨胳發(fā)育異常疾病，在患者的骨胳上可觀察到大小不等的骨隆起。該病為常染色體顯性遺傳疾病，患者多在青少年時(shí)期發(fā)病，且大部分的患者有家族遺傳史。該腫瘤可干擾正常骨骺的生長(zhǎng)導(dǎo)致骨骼畸形。患者大多身材矮小、肢體力線異常以及功能障礙。MO一個(gè)顯著的特征是有一形似帽子的軟骨層（即軟骨帽）位于瘤體的頂部。軟骨帽可以通過(guò)其深層的軟骨化骨作用促使MO不斷增生，瘤

2、體體積增大可以導(dǎo)致病人局部疼痛，甚至可能引起骨骼畸形，因而引起運(yùn)動(dòng)功能障礙或使鄰近的血管神經(jīng)受壓導(dǎo)致相應(yīng)病變。另外，急速的瘤體增生是該病惡變的征兆。目前，針對(duì)多發(fā)性骨軟骨瘤的藥物仍處于研發(fā)階段，MO的治療還主要依賴手術(shù)。MO的手術(shù)治療主要有瘤體切除和為改善外觀畸形和肢體功能的矯形等。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，人們從微觀領(lǐng)域?qū)O的研究和認(rèn)識(shí)也越來(lái)越多，對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究也逐步深入。
　　MO病理解剖后，可見(jiàn)MO呈菜花狀

3、，由軟骨膜、軟骨帽和骨性瘤體組成。軟骨膜作為軟骨重要組成部分，軟骨膜由兩層組成，其中外層中有相對(duì)比較致密的膠原纖維，其對(duì)軟骨主要起保護(hù)作用;而內(nèi)側(cè)的纖維較疏松，但是細(xì)胞數(shù)量相對(duì)較多，其中的一些梭形小細(xì)胞為骨原細(xì)胞，其可增殖分化為軟骨細(xì)胞，因而其與軟骨的生長(zhǎng)有密切的關(guān)系，目前對(duì)其在軟骨瘤患者中發(fā)生的病理變化研究甚少。分子生物學(xué)研究顯示，有多種細(xì)胞因子在骨骼形成過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。Sox9（Sex Determining RegionY

4、Box Protein9）是軟骨形成過(guò)程中重要的轉(zhuǎn)錄因子，該基因開(kāi)啟后可促使間充質(zhì)干細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞。軟骨形成早期，Sox9在間充質(zhì)干細(xì)胞的定向分化聚集過(guò)程發(fā)揮重要作用。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，Osterix基因與成骨細(xì)胞分化和骨骼形成關(guān)系緊密，并且Osterix能調(diào)節(jié)眾多成骨因子的表達(dá)，從而合成基質(zhì)，發(fā)生礦化反應(yīng)，最終實(shí)現(xiàn)骨的形成。
　　本研究首先通過(guò)掃描電鏡和透射電鏡觀察了MO軟骨帽及軟骨膜的超微結(jié)構(gòu)，使人們對(duì)MO的超微病理結(jié)構(gòu)有

5、更多的了解，為探索MO的發(fā)病機(jī)制提供參考，更有利于提高M(jìn)O超微病理診斷。我們又觀察了Sox9和Osterix兩個(gè)基因在骨軟骨瘤組織標(biāo)本和骨軟骨瘤組織外周血血清中的表達(dá)量，并對(duì)兩基因進(jìn)行了相關(guān)性分析，旨在探索多發(fā)性骨軟骨瘤可能的發(fā)病機(jī)理。本課題包括以下三部分:
　　1.多發(fā)性骨軟骨瘤軟骨帽超微結(jié)構(gòu)的觀察;
　　2.多發(fā)性骨軟骨瘤軟骨膜超微結(jié)構(gòu)的觀察;
　　3.多發(fā)性骨軟骨瘤分子機(jī)制研究。
　　第一部分 多發(fā)性骨軟骨

6、瘤軟骨帽超微結(jié)構(gòu)的觀察
　　方法：
　　1.標(biāo)本選取，MO組:手術(shù)切除的瘤體并經(jīng)病理檢查確診的MO患者的骨軟骨瘤組織標(biāo)本30例;對(duì)照組:行髖脫位截骨術(shù)后殘余的髂骨翼骨軟骨的組織標(biāo)本30例。
　　2.掃描電鏡觀察正常軟骨組織和MO患者骨軟骨瘤的軟骨帽標(biāo)本。
　　3.透射電鏡觀察正常軟骨組織和MO患者骨軟骨瘤的軟骨帽標(biāo)本。
　　結(jié)果：
　　1.正常軟骨組織和MO患者骨軟骨瘤的軟骨帽標(biāo)本掃描電鏡觀察結(jié)果

7、r>　　對(duì)照組（正常髂骨翼骨軟骨組織）:在軟骨陷窩內(nèi)可以看到有較少的軟骨細(xì)胞存在，這些細(xì)胞的主要形狀有圓形或不規(guī)則形，在軟骨細(xì)胞表面上發(fā)現(xiàn)有較少的突起，此外，有較多散狀排列、密度較稀疏的膠原纖維附于軟骨陷窩周圍。
　　MO組（MO患者骨軟骨瘤軟骨帽）:有較多形狀不一的軟骨陷窩存在于軟骨組織中，且與對(duì)照相比，陷窩內(nèi)有大量的體積較大的軟骨細(xì)胞，這些軟骨細(xì)胞的主要特征是形狀不規(guī)則，細(xì)胞表面突起豐富，結(jié)構(gòu)較致密的膠原纖維存在于軟骨陷窩周圍

8、。
　　2.正常軟骨組織和MO患者骨軟骨瘤的軟骨帽標(biāo)本透射電鏡觀察結(jié)果
　　對(duì)照組（正常髂骨翼骨軟骨組織）:可見(jiàn)少量的軟骨細(xì)胞，大多數(shù)的細(xì)胞為橢圓形，細(xì)胞表面有較少的微絨毛;細(xì)胞核形狀大多呈現(xiàn)不規(guī)則狀，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)邊緣有凝集;細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞器較少，有呈條索狀分布的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，一些粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上有核糖體顆粒分布;線粒體的形狀為圓形，且體積比較小;細(xì)胞質(zhì)內(nèi)還發(fā)現(xiàn)有簇狀分布的糖原顆粒。
　　MO組（MO患者骨軟骨瘤軟骨帽）

9、:軟骨細(xì)胞數(shù)量多，體積大，呈梭形，細(xì)胞核的體積增長(zhǎng)且形狀為圓形;在細(xì)胞核內(nèi)可見(jiàn)豐富的染色質(zhì)及清楚的核仁，細(xì)胞的核質(zhì)比升高;線粒體數(shù)量較少，線粒體呈圓形或橢圓形;有大量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)，這些粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈現(xiàn)擴(kuò)張狀態(tài)，有低電子密度物質(zhì)沉積于此;在細(xì)胞內(nèi)溶酶體較少;游離核糖體常可見(jiàn)到;細(xì)胞間亦有蛋白樣物質(zhì)的沉積。
　　第二部分 多發(fā)性骨軟骨瘤軟骨膜超微結(jié)構(gòu)的觀察
　　方法：
　　1.標(biāo)本選取，MO組:手術(shù)切除的瘤體并經(jīng)病理檢查

10、確診的MO患者的骨軟骨瘤組織標(biāo)本30例;對(duì)照組:行髖脫位截骨術(shù)后殘余的髂骨翼骨軟骨的組織標(biāo)本30例。
　　2.掃描電鏡觀察正常組織軟骨膜和MO患者骨軟骨瘤軟骨膜標(biāo)本。
　　3.透射電鏡觀察正常組織軟骨膜和MO患者骨軟骨瘤軟骨膜標(biāo)本。
　　結(jié)果：
　　1.正常組織軟骨膜和MO患者骨軟骨瘤軟骨膜標(biāo)本掃描電鏡觀察結(jié)果
　　對(duì)照組（正常組織軟骨膜）:有大量膠原纖維存在，且其排列疏松呈束狀。
　　MO組（MO患

11、者骨軟骨瘤軟骨膜）:有大量膠原纖維存在，并呈密集排列，但其排列不規(guī)則，呈簇狀。
　　2.正常軟骨膜和MO患者骨軟骨瘤軟骨膜標(biāo)本透射電鏡觀察結(jié)果
　　對(duì)照組（正常組織軟骨膜）:成纖維細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，呈梭形或不規(guī)則狀，成纖維細(xì)胞無(wú)突起、無(wú)細(xì)胞分泌現(xiàn)象;核仁體積較小，呈圓形或橢圓形，核內(nèi)染色質(zhì)凝集;粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較豐富，線粒體無(wú)明顯增大增粗現(xiàn)象;細(xì)胞質(zhì)內(nèi)未見(jiàn)膠原蛋白;軟骨膜中可見(jiàn)大量膠原纖維密集交錯(cuò)排列;成纖維細(xì)胞周圍未見(jiàn)膠原微纖微分泌

12、及毛細(xì)血管形成。
　　MO組(MO患者骨軟骨瘤軟骨膜):成纖維細(xì)胞呈圓形或橢圓形，周圍分泌大量細(xì)絲狀膠原微纖維，在成纖維細(xì)胞周圍呈局部密集狀分布;細(xì)胞核體積較大，呈圓形，核內(nèi)常染色質(zhì)較豐富;粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)異常豐富且呈輕度擴(kuò)張狀態(tài)，線粒體輕度增大增粗;細(xì)胞質(zhì)內(nèi)見(jiàn)大量的均質(zhì)膠原蛋白，電子密度低;軟骨膜中膠原纖維豐富，呈密集交錯(cuò)狀，局部可見(jiàn)新生毛細(xì)血管或血管閉鎖。
　　第三部分 多發(fā)性骨軟骨瘤分子機(jī)制研究
　　方法：
　　

13、1.免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)Sox9和Osterix在正常軟骨組織和骨軟骨瘤組織中的表達(dá)情況。
　　2.MO患者骨軟骨瘤組織標(biāo)本中Sox9和Osterix表達(dá)的相關(guān)性分析。
　　3.ELISA方法檢測(cè)對(duì)照組和MO組外周血清中Sox9和Osterix的表達(dá)情況。
　　4.MO患者外周血清中Sox9和Osterix濃度的相關(guān)性分析。
　　5.qRT-PCR檢測(cè)正常軟骨組織和骨軟骨瘤組織中Sox9和Osterix mRN

14、A的表達(dá)情況。
　　6.MO組軟骨組織標(biāo)本中，分析在mRNA水平上Sox9與Osterix之間的相關(guān)性。
　　7.Western blot檢測(cè)Sox9和Osterix蛋白在MO骨軟骨瘤組織和正常軟骨組織中的表達(dá)情況。
　　8.分析MO組織及正常髂骨脊骨軟骨組織軟骨膜及軟骨帽中膠原纖維和毛細(xì)血管的形態(tài)與Sox9和Osterix蛋白表達(dá)的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1.免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，Sox9和Osterix

15、蛋白在對(duì)照組和MO組軟骨標(biāo)本中均有不同程度的陽(yáng)性表達(dá)，但在MO組軟骨組織標(biāo)本中的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組。
　　2.統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，MO組軟骨組織標(biāo)本中Sox9與Osterix的表達(dá)水平之間呈正相關(guān)關(guān)系。
　　3.ELISA方法檢測(cè)結(jié)果顯示，Sox9和Osterix在MO組外周血中的濃度水平明顯高于對(duì)照組。
　　4.MO患者外周血清中Sox9和Osterix濃度呈正相關(guān)關(guān)系。
　　5.qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，So

16、x9和Osterix在MO組軟骨組織標(biāo)本中的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組。
　　6.qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，MO組軟骨組織標(biāo)本中Sox9與Osterix mRNA的表達(dá)水平之間呈正相關(guān)性。
　　7.Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，Sox9和Osterix蛋白在MO組軟骨組織標(biāo)本中的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組。
　　8.骨軟骨瘤內(nèi)的毛細(xì)血管生成和膠原纖維的形成可能與Sox9和Osterix蛋白表達(dá)有關(guān)。
　　結(jié)論：

17、
　　1.與正常的軟骨組織相比，MO患者骨軟骨瘤軟骨帽的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯改變，MO患者骨軟骨瘤軟骨帽中的軟骨組織代謝異常的旺盛，細(xì)胞生長(zhǎng)及蛋白質(zhì)合成明顯升高，MO軟骨帽中的膠原纖維變得致密并有鈣化傾向，促進(jìn)了骨軟骨瘤的發(fā)生發(fā)展及惡變。
　　2.與正常的軟骨組織相比，MO患者骨軟骨瘤軟骨膜的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，提示MO患者骨軟骨瘤軟骨膜中的軟骨組織代謝活動(dòng)異常的活躍，并且軟骨細(xì)胞增殖及蛋白質(zhì)合成等生命活動(dòng)加快，部分的軟骨