KHSRP在坐骨神經(jīng)損傷后的表達及功能研究.pdf

1、目的:
　　研究KHSRP在坐骨神經(jīng)損傷后的表達情況，探究KHSRP與施萬細胞分化和神經(jīng)元軸突再生的關系，分析KHSRP與β-catenin的相互調節(jié)關系及兩者在施萬細胞分化和神經(jīng)元軸突再生過程中的作用，進一步揭示KHSRP在周圍神經(jīng)損傷后的再生機制。
　　方法:
　　1.為了研究KHSRP在損傷后坐骨神經(jīng)中的表達，本研究通過構建大鼠坐骨神經(jīng)夾傷模型，利用western blot，免疫組織化學技術檢測了KHSRP在正常

2、組織及損傷組織中的表達；采用免疫熒光方法檢測了KHSRP的細胞定位情況，分析其與施萬細胞分化和神經(jīng)元軸突再生的關系
　　2.為了研究KHSRP在施萬細胞分化過程中的作用，本研究通過構建原代施萬細胞體外分化模型，western blot及RT-PCR技術檢測KHSRP、β-catenin及相關蛋白在此過程中的表達情況；通過核漿分離檢測KHSRP的胞漿轉移情況；通過構建KHSRP小干擾RNA及β-catenin過表達質粒并結合免疫細胞

3、熒光技術檢測KHSRP是否通過調節(jié)β-catenin的穩(wěn)定性從而介導施萬細胞的分化。
　　3.為了研究KHSRP在神經(jīng)元突起生長過程中的作用，采用100ng/ml NGF刺激未分化的PC12細胞，模擬神經(jīng)元體外分化過程，以及構建原代DRG神經(jīng)元體外發(fā)育模型，檢測KHSRP在神經(jīng)元延伸過程中的表達、胞漿轉運及對神經(jīng)元突起延伸的影響。
　　4.原代施萬細胞和神經(jīng)元的共培養(yǎng)，模擬坐骨神經(jīng)損傷后施萬細胞的再成髓鞘化過程，檢測KHSR

4、P、β-catenin的表達及KHSRP的胞漿運輸對β-catenin穩(wěn)定性的影響。
　　結果:
　　1. western blot及免疫組化分析顯示，KHSRP在坐骨神經(jīng)損傷后表達升高，在第5天達到最高，隨后逐漸回復。免疫熒光結果顯示KHSRP在NF200、S100及Oct-6陽性的細胞中均有表達，提示KHSRP可能在施萬細胞分化和神經(jīng)元軸突再生過程中發(fā)揮作用。
　　2.在cAMP誘導的施萬細胞分化過程中，KHSRP

5、的表達升高，而β-catenin的表達降低。核漿分離結果顯示 KHSRP在分化過程中胞漿蛋白水平增加，相應此時β-catenin的胞漿蛋白水平降低，提示KHSRP可能通過調節(jié)β-catenin的穩(wěn)定性來介導施萬細胞的分化。KHSRP的小干擾RNA轉染施萬細胞后抑制了施萬細胞分化的形態(tài)發(fā)生，該效應與過表達β-catenin的施萬細胞形態(tài)相似。
　　3. NGF刺激 PC12細胞分化和體外培養(yǎng)的原代 DRG神經(jīng)元發(fā)育的過程中，KHSR

6、P的蛋白及mRNA水平的表達均升高，而β-catenin成相反趨勢。此外也相應觀察到KHSRP的胞漿聚集及β-catenin的胞漿穩(wěn)定性降低現(xiàn)象。KHSRP的小干擾RNA轉染的PC12或DRG神經(jīng)元突起延伸也受到影響。
　　4.施萬細胞和DRG神經(jīng)元共培養(yǎng)過程中，KHSRP在1d表達最低，隨后隨著施萬細胞髓鞘化，表達逐漸增高，β-catenin的表達呈相反趨勢。核漿分離也顯示出KHSRP的胞漿轉移及β-catenin的穩(wěn)定性衰退現(xiàn)