FoxM1調(diào)控DAN損傷修復(fù)在慢性髓性白血病伊馬替尼耐藥中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　慢性髓性白血病(Chronic myeloid leukemia，CML)是造血干細(xì)胞發(fā)生惡性克隆產(chǎn)生的一種疾病，按臨床病程可分為慢性期(Chronic Phase，CP)、加速期(Accelerated Phase，AP)和急變期(Blast Crisis，BC)。一旦進(jìn)入急變期，預(yù)后極差。費(fèi)城染色體(Ph)和BCR-ABL基因融合是CML的標(biāo)志性改變。抑制酪氨酸激酶活性的抑制劑伊馬替尼(Imatinib，IM)

2、能夠靶向BCR-ABL融合蛋白，成為目前CML治療的一線藥物。然而，隨著時(shí)間的推移，越來(lái)越多的CML患者出現(xiàn)IM耐藥，這嚴(yán)重制約了CML療效的提高，目前已成為CML靶向治療面臨的主要挑戰(zhàn)。研究發(fā)現(xiàn)，CML患者IM耐藥的主要原因之一是BCR-ABL基因點(diǎn)突變或擴(kuò)增導(dǎo)致的酪氨酸激酶活性持續(xù)增高。因此，探索BCR-ABL依賴IM耐藥的機(jī)制及其逆轉(zhuǎn)對(duì)策是當(dāng)前臨床上CML治療關(guān)注的焦點(diǎn)。
　　越來(lái)越多的證據(jù)顯示，DNA損傷修復(fù)對(duì)基因組維持完

3、整性和穩(wěn)定性至關(guān)重要，其功能異常導(dǎo)致的基因組不穩(wěn)定與CML疾病進(jìn)展及耐藥性的產(chǎn)生關(guān)系密切。研究顯示，阻斷DNA雙鏈斷裂(DNA double strand break，DSB)的修復(fù)能使CML細(xì)胞Mo7e-P210 IMR和Baf3-P210 IMR對(duì)IM敏感性增強(qiáng)。另有研究報(bào)道，應(yīng)用小分子抑制劑IBR2下調(diào)DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因RAD51的表達(dá)，可引起IM耐藥細(xì)胞T315I-Ba/F3增殖受抑、凋亡增加，并明顯增強(qiáng)耐藥細(xì)胞對(duì)IM的敏感

4、性。由此可見，DNA損傷修復(fù)在CML細(xì)胞IM耐藥中發(fā)揮著重要作用，可能是一種新的IM耐藥機(jī)制，闡明其作用機(jī)理對(duì)克服IM耐藥具有重要意義。
　　近來(lái)研究顯示，增殖特異性癌基因FoxM1（Forkhead box protein M1）能夠靶向BRIP1、RAD51、BRCA2等多種DNA損傷修復(fù)蛋白，調(diào)控DNA損傷修復(fù)，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、乳腺癌等多種腫瘤的化療藥物抵抗中發(fā)揮重要作用。FoxM1可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)特異性基因的轉(zhuǎn)錄，與細(xì)胞

5、增殖、組織再生、胚胎發(fā)育、DNA損傷修復(fù)和腫瘤形成密切相關(guān)。新近研究證明，F(xiàn)oxM1在乳腺癌等多種腫瘤中過(guò)表達(dá)，其高表達(dá)的腫瘤具有低分化、惡性程度高、易遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，臨床預(yù)后不佳。FoxM1通過(guò)調(diào)控其下游腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)，影響基因組的穩(wěn)定性及有絲分裂的進(jìn)程，從而促進(jìn)腫瘤增長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用。綜上，F(xiàn)oxM1是腫瘤增殖所必需的轉(zhuǎn)錄因子，探討其在CML IM耐藥中的作用及機(jī)制，可為逆轉(zhuǎn)IM耐藥帶來(lái)全新的治療思

6、路和方案，提供臨床治療的新靶點(diǎn)。
　　研究目的:
　　研究FoxM1在不同臨床分期的CML患者中表達(dá)水平，分析FoxM1表達(dá)與疾病進(jìn)展及IM耐藥的關(guān)系，探討FoxM1對(duì)CML預(yù)后的臨床意義;研究干預(yù)FoxM1表達(dá)對(duì)CML細(xì)胞生物學(xué)行為的影響;闡明FoxM1對(duì)DNA損傷修復(fù)的調(diào)控作用，進(jìn)一步揭示FoxM1參與IM耐藥的作用機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.檢測(cè)CML患者FoxM1表達(dá)，分析其與CML疾病分期和IM耐藥

7、的關(guān)系，評(píng)價(jià)FoxM1分子對(duì)CML發(fā)病及預(yù)后的臨床意義。
　　1.1標(biāo)本收集:收集50例CML患者及12例正常對(duì)照者骨髓的標(biāo)本，CML患者分為慢性期(CP)組38例，加速/急變期(AP/BP)組12例，其中初診組19例。使用淋巴細(xì)胞分離液采用密度梯度離心法來(lái)分離單個(gè)核細(xì)胞，-80℃凍存。
　　1.2免疫磁珠分選骨髓CD34+及CD34-單個(gè)核細(xì)胞:骨髓單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)＞1×108的CML患者標(biāo)本13例及臍帶血標(biāo)本6例，使用淋巴

8、細(xì)胞分離液采用密度梯度離心法來(lái)分離出單個(gè)核細(xì)胞后，留取1×106個(gè)細(xì)胞，-80℃保存?zhèn)溆?剩余細(xì)胞使用CD34+磁珠分選法獲得CD34+及CD34-細(xì)胞，-80℃保存?zhèn)溆谩?br>　　1.3實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(Real-time QuantitativePolymerase Chain Reaction，RT-PCR)檢測(cè)Fox M1的表達(dá)水平:采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，應(yīng)用PrimeScript RT rea

9、gent試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，SYBR Green法檢測(cè)CML患者及正常對(duì)照者的單個(gè)核細(xì)胞、CD34+及CD34-單個(gè)核細(xì)胞中Fox M1表達(dá)情況。
　　2.研究IM耐藥CML細(xì)胞株K562/G01及其IM敏感株K562對(duì)IM的藥物敏感性、FoxM1表達(dá)及DNA損傷修復(fù)情況。
　　2.1 CCK8法檢測(cè)CML細(xì)胞對(duì)IM敏感性:配制不同濃度梯度的IM溶液，分別處理IM敏感株K562細(xì)胞和IM耐藥株（BCR-ABL過(guò)度

10、擴(kuò)增）K562/G01細(xì)胞48小時(shí)，CCK8法檢測(cè)并計(jì)算細(xì)胞存活率及IC50值。
　　2.2 AnnexinⅤ-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)(FACS)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率:IM分別處理K562細(xì)胞和K562/G01細(xì)胞48h，AnnexinⅤ-FITC和PI進(jìn)行雙染細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。
　　2.3 Western-blot法檢測(cè)K562細(xì)胞及K562/G01細(xì)胞的FoxM1、BCR-ABL激酶活性蛋白及DNA

11、損傷標(biāo)志物的表達(dá):細(xì)胞總蛋白提取液分別提取K562細(xì)胞和K562/G01細(xì)胞的總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，檢測(cè)FoxM1、BCR-ABL激酶活性蛋白P-Tyr和P-Crkl及DNA損傷標(biāo)志物γ-H2AX的表達(dá)。
　　2.4免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞DNA損傷修復(fù)情況:同樣濃度的IM處理K562細(xì)胞和K562/G01細(xì)胞6小時(shí)，利用免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞中DNA損傷標(biāo)志物γ-H2AX的表達(dá)。
　　3.研究干預(yù)FoxM1表達(dá)對(duì)CM

12、L細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　3.1上、下調(diào)CML細(xì)胞中FoxM1的表達(dá):(1)慢病毒感染細(xì)胞:分別應(yīng)用FoxM1攜帶過(guò)表達(dá)載體的慢病毒及其過(guò)表達(dá)對(duì)照病毒感染IM敏感細(xì)胞株K562;應(yīng)用攜帶FoxM1干擾片段shRNA的慢病毒及其干擾對(duì)照病毒感染IM耐藥細(xì)胞株K562/G01。使用嘌呤霉素(puromycin)篩選2周，獲得穩(wěn)定過(guò)表達(dá)或低表達(dá)FoxM1的CML細(xì)胞株。(2)利用FoxM1的小分子抑制劑下調(diào)CML患者CD34+細(xì)胞中

13、FoxM1表達(dá):硫鏈絲菌素(Thiostrepton，TST)、硼替佐米(Bortezomib，BTZ)處理K562/G01細(xì)胞及CD34+細(xì)胞48小時(shí)。
　　3.2 Real-time RT-PCR法檢測(cè)干預(yù)FoxM1表達(dá)后CML細(xì)胞的FoxM1及其下游分子的mRNA表達(dá)水平。
　　3.3 Western-blot法檢測(cè)干預(yù)FoxM1表達(dá)后CML細(xì)胞的FoxM1分子、BCR-ABL激酶活性蛋白P-Tyr、P-Crkl的表達(dá)

14、。
　　3.4 CCK8法研究干預(yù)FoxM1表達(dá)后CML細(xì)胞IM敏感性的改變:配制不同濃度梯度的IM溶液處理各組細(xì)胞，48小時(shí)后檢測(cè)并計(jì)算細(xì)胞存活率及IC50值。
　　3.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)干預(yù)FoxM1表達(dá)后CML細(xì)胞株和原代CD34+細(xì)胞的凋亡情況:IM處理各組細(xì)胞，48小時(shí)后收集細(xì)胞，AnnexinⅤ-FITC/PI進(jìn)行雙染后，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。
　　3.6 Western-blot檢測(cè)干預(yù)FoxM1

15、表達(dá)后CML細(xì)胞DNA損傷標(biāo)志物γ-H2AX的蛋白表達(dá)水平;免疫熒光法檢測(cè)干預(yù)FoxM1表達(dá)后CML細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)情況:IM處理各組細(xì)胞，利用免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞中DNA損傷標(biāo)志物γ-H2AX的表達(dá)。
　　4.篩選并鑒定參與CML細(xì)胞IM耐藥的FoxM1關(guān)鍵下游DNA損傷修復(fù)基因。
　　4.1全基因表達(dá)譜芯片法:分別收集FoxM1過(guò)表達(dá)及FoxM1 shRNA慢病毒處理前后的CML細(xì)胞，利用基因芯片檢測(cè)各組間差異表達(dá)的基

16、因，作為FoxM1調(diào)控的參與IM耐藥的候選下游DNA損傷修復(fù)基因。
　　4.2 Real-time RT-PCR法驗(yàn)證各候選下游DNA損傷修復(fù)基因表達(dá):在FoxM1過(guò)表達(dá)慢病毒感染前后CML細(xì)胞中檢測(cè)各候選DNA損傷修復(fù)基因的mRNA表達(dá)水平。選擇一個(gè)表達(dá)差異顯著的候選下游基因作為目標(biāo)下游DNA損傷修復(fù)基因。
　　4.3 Western-blot法驗(yàn)證目標(biāo)FoxM1目標(biāo)下游DNA損傷修復(fù)基因的表達(dá):細(xì)胞總蛋白提取液提取干預(yù)F

17、oxM1表達(dá)的CML細(xì)胞的總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，檢測(cè)目標(biāo)下游DNA損傷修復(fù)基因蛋白水平的表達(dá)。
　　5.研究FoxM通過(guò)調(diào)控目標(biāo)下游DNA損傷修復(fù)基因，對(duì)CML細(xì)胞生物學(xué)行為產(chǎn)生的影響。
　　5.1質(zhì)粒及病毒轉(zhuǎn)染:應(yīng)用攜帶目標(biāo)下游DNA損傷修復(fù)基因干擾片段shRNA的慢病毒及其干擾對(duì)照病毒感染K562/G01細(xì)胞;應(yīng)用LipofectamineTM2000將攜帶目標(biāo)下游DNA損傷修復(fù)基因過(guò)表達(dá)載體的質(zhì)粒及其過(guò)

18、表達(dá)對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染FoxM1低表達(dá)的K562/G01細(xì)胞（感染攜帶FoxM1干擾片段shRNA慢病毒并穩(wěn)定表達(dá)的K562/G01細(xì)胞）。嘌呤霉素篩選2周后獲得穩(wěn)定過(guò)表達(dá)或低表達(dá)目標(biāo)下游DNA損傷修復(fù)基因的細(xì)胞株及其對(duì)照細(xì)胞株。
　　5.2 Real-time RT-PCR檢測(cè)干預(yù)目標(biāo)下游DNA損傷修復(fù)基因后CML細(xì)胞中其mRNA表達(dá)水平;Western-Blot檢測(cè)干預(yù)目標(biāo)下游DNA損傷修復(fù)基因后CML細(xì)胞中其蛋白表達(dá)水平、BCR-

19、ABL激酶活性蛋白P-Tyr。
　　5.3 CCK8法檢測(cè)干預(yù)目標(biāo)下游DNA損傷修復(fù)基因后CML細(xì)胞對(duì)IM的敏感性:IM處理各組細(xì)胞48小時(shí)后，CCK8法檢測(cè)并計(jì)算細(xì)胞的存活率及IC50值。
　　5.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)干預(yù)目標(biāo)下游DNA損傷修復(fù)基因后CML細(xì)胞的凋亡情況:IM處理各組細(xì)胞，48小時(shí)后收集細(xì)胞，AnnexinⅤ-FITC/PI進(jìn)行雙染后利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。
　　5.5 Western-Blot檢測(cè)

20、干預(yù)目標(biāo)下游DNA損傷修復(fù)基因后CML細(xì)胞中DNA損傷標(biāo)志物γ-H2AX的蛋白表達(dá)水平;免疫熒光法檢測(cè)干預(yù)目標(biāo)下游DNA損傷修復(fù)基因后CML細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)情況:IM處理各組細(xì)胞，6小時(shí)后應(yīng)用免疫熒光法檢測(cè)各組細(xì)胞DNA損傷標(biāo)志物γ-H2AX蛋白水平的表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1.FoxM1在CML患者及正常對(duì)照中的表達(dá)。
　　1.1 FoxM1在CML患者與正常對(duì)照中的表達(dá):Real-time RT-PCR結(jié)果顯

21、示在初診CML患者中FoxM1 mRNA的表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組;FoxM1表達(dá)與CML患者疾病分期有關(guān)，AP/BP組患者的FoxM1表達(dá)水平明顯高于CP組患者;FoxM1表達(dá)與IM敏感性有關(guān)，初診CP患者經(jīng)IM治療無(wú)效后如進(jìn)展為AP/BC，其FoxM1表達(dá)水平呈上升趨勢(shì);初診CP患者經(jīng)IM治療后若穩(wěn)定于完全緩解階段，其FoxM1表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)。
　　1.2 FoxM1在CML干細(xì)胞中的表達(dá):FoxM1 mRNA在CML患

22、者CD34+細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯高于CD34-細(xì)胞和正常對(duì)照組CD34+細(xì)胞;在正常對(duì)照組CD34+及CD34-細(xì)胞的FoxM1 mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.所選IM耐藥CML細(xì)胞株K562/G01及其敏感株K562對(duì)IM的藥物敏感性。
　　2.1 CCK8法顯示IM耐藥株K562/G01細(xì)胞對(duì)IM的IC50為IM敏感株K562的約40倍。
　　2.2流式細(xì)胞術(shù)顯示IM處理細(xì)胞48h后，K562/G01

23、細(xì)胞的凋亡率明顯低于K562細(xì)胞。
　　2.3 Western-blot顯示K562/G01細(xì)胞中FoxM1、BCR-ABL激酶活性蛋白P-Tyr和P-Crkl的表達(dá)明顯高于K562細(xì)胞，DNA損傷標(biāo)志物γ-H2AX表達(dá)明顯低于K562細(xì)胞。
　　2.4免疫熒光法顯示K562/G01細(xì)胞中DNA損傷標(biāo)志物γ-H2AX表達(dá)明顯低于K562細(xì)胞。
　　3.FoxM1調(diào)控CML細(xì)胞BCR-ABL激酶活性及IM敏感性檢測(cè)。

24、r>　　3.1上調(diào)IM敏感細(xì)胞株K562中FoxM1表達(dá)對(duì)細(xì)胞IM敏感性的影響:Real-time RT-PCR、Western-blot驗(yàn)證FoxM1 mRNA及蛋白水平上調(diào)后，CCK8法顯示細(xì)胞存活率升高，IC50值增大;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡明顯減少;Western-blot顯示BCR-ABL激酶活性標(biāo)志P-Tyr、P-Crkl蛋白表達(dá)水平升高;Western-blot及免疫熒光顯示DNA損傷標(biāo)志物γ-H2AX表達(dá)水平降低。

25、>　　3.2下調(diào)IM耐藥細(xì)胞株K562/G01中FoxM1表達(dá)對(duì)細(xì)胞IM敏感性的影響:Real-timeRT-PCR、Western-blot驗(yàn)證FoxM1的mRNA及蛋白水平下調(diào)后，CCK8法顯示細(xì)胞存活率降低，IC50值減小;流式細(xì)胞術(shù)顯示細(xì)胞凋亡顯著增加;Western-blot檢測(cè)BCR-ABL激酶活性標(biāo)志P-Tyr、P-Crkl蛋白表達(dá)水平降低;Western-blot及免疫熒光顯示DNA損傷標(biāo)志物γ-H2AX表達(dá)水平升高。<

26、br>　　3.3應(yīng)用FoxM1的小分子抑制劑下調(diào)CML患者骨髓CD34+細(xì)胞的FoxM1表達(dá)對(duì)細(xì)胞IM敏感性的影響:Annexin-Ⅴ FITC/PI進(jìn)行雙染，流式細(xì)胞術(shù)顯示細(xì)胞凋亡明顯增加。
　　4.鑒定并選擇參與IM耐藥的FoxM1下游關(guān)鍵的DNA損傷修復(fù)基因。
　　4.1根據(jù)芯片結(jié)果及比較干預(yù)FoxM1前后CML細(xì)胞中各候選基因mRNA表達(dá)水平結(jié)果，初步選擇PARP作為FoxM1調(diào)控參與IM耐藥的目標(biāo)下游DNA損傷修復(fù)

27、基因。
　　4.2 IM耐藥細(xì)胞株K562/G01中下調(diào)PARP的表達(dá):Real-time RT-PCR、Western-Blot驗(yàn)證PARP的mRNA及蛋白表達(dá)水平降低;CCK8法顯示細(xì)胞存活率降低，IC50值減小;AnnexinⅤ-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)顯示細(xì)胞凋亡增加;Western-blot、免疫熒光顯示DNA損傷標(biāo)志物γ-H2AX表達(dá)水平升高。
　　4.3 FoxM1低表達(dá)的K562/G01細(xì)胞中上調(diào)PARP

28、的表達(dá):Real-time RT-PCR、Western-Blot驗(yàn)證PARP的mRNA及蛋白表達(dá)水平升高;CCK8法顯示細(xì)胞存活率升高，IC50值增大;AnnexinⅤ-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)顯示細(xì)胞凋亡減少;Western-blot、免疫熒光顯示DNA損傷標(biāo)志物γ-H2AX表達(dá)水平降低。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論
　　1.FoxM1在初診CML患者中明顯高表達(dá)，在不同疾病分期及不同IM療效的CML患者中存在明顯差異表達(dá)，提示了

29、FoxM1可能參與CML疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程，且可能與CML IM耐藥關(guān)系密切。
　　2.FoxM1在CML患者CD34+細(xì)胞中表達(dá)量明顯高于其CD34-細(xì)胞和正常對(duì)照組CD34+細(xì)胞，提示FoxM1在維持CML干細(xì)胞的存活和自我更新中起一定的作用。
　　3.FoxM1信號(hào)通路可通過(guò)促進(jìn)DNA損傷修復(fù)，抑制CML細(xì)胞凋亡并增強(qiáng)BCR-ABL激酶活性，從而促進(jìn)IM耐藥。
　　4.鑒定出PARP是FoxM1調(diào)控參與IM耐藥的下