新型Bcr-Abl-Src激酶抑制劑FB2抗伊馬替尼耐藥慢性髓系白血病作用及機(jī)制研究;K562-Imatinib獲得性耐藥細(xì)胞的耐藥機(jī)制研究.pdf

1、慢性髓系白血病(CML)是一種起源于造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，其特征性遺傳學(xué)標(biāo)志是由染色體易位形成費(fèi)城(Ph)染色體。由易位染色體產(chǎn)生的Bcr-Ab1融合基因編碼產(chǎn)生分子量為210kD的Bcr-Ab1融合蛋白，最初在造血干細(xì)胞中表達(dá)，促進(jìn)骨髓及淋巴樣細(xì)胞的分化，具有異常增高的蛋白酪氨酸激酶活性，被認(rèn)為是CML發(fā)病的始發(fā)因素。
　　 傳統(tǒng)的CML的治療采用羥基脲、馬利蘭、甲異靛及干擾素等藥物療效欠佳且副作用大。隨著對Bcr-Ab

2、1蛋白活性的深入研究，使其成為CML治療的重要的分子靶點(diǎn)。伊馬替尼(Imatinib)作為小分子Bcr-Ab1酪氨酸激酶抑制劑以其顯著的療效及毒副作用低的特點(diǎn)，成為目前CML治療的一線用藥。但隨著臨床用藥的增加Imatinib耐藥問題逐漸突顯。另外，Imatinib不能根除殘留的白血病干細(xì)胞及原始祖細(xì)胞，成為疾病復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素。因此尋找新靶點(diǎn)或多靶點(diǎn)藥物成為CML研究的熱點(diǎn)。
　　 臨床上常見的獲得性Imatinib耐藥機(jī)制主要

3、分為兩類：Bcr-Ab1依賴型及Bcr-Ab1非依賴型。Bcr-Ab1依賴型耐藥中主要原因?yàn)锽cr-Ab1基因發(fā)生位點(diǎn)突變以及擴(kuò)增引起的表達(dá)增加。另外，從Immatnib耐藥的患者中分離的細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)Src激酶家族(SFK)成員中Lyn及Hck過表達(dá)，提示SFK涉及Bcr-Ab1非依賴型Imatinib耐藥。由于Ab1與SFK成員中具有明顯的序列同源性及活性中心結(jié)構(gòu)相似性。因此，在對多種不同化學(xué)結(jié)構(gòu)的Src激酶抑制劑的研究中包括Bosu

4、tinib、Dasatinib及INNO-0406等，發(fā)現(xiàn)這些化合物能夠較Imatinib更有效地抑制Bcr-Ab1激酶活性，并且對多種位點(diǎn)突變的Bcr-Ab1有效。
　　 FB2是一種新型的噻唑類衍生物，前期研究已經(jīng)證實(shí)其可有效地抑制Imatinib敏感及無Bcr-Ab1點(diǎn)突變的耐藥K562細(xì)胞系。本研究將觀察FB2對Imatinib耐藥的具有Ab1激酶點(diǎn)突變的Ba/F3P210（WT、Y253F及T315I）白血病細(xì)胞的作用

5、及機(jī)制，并建立四種不同的動(dòng)物模型Ph+的K562及體外建立的Imatinib耐藥株K562/G7.0NOD/SCID小鼠模型，Ba/F3P210（WT及Y253）白血病小鼠模型，以觀察FB2對不同耐藥機(jī)制動(dòng)物模型中位生存期的影響。
　　 基于FB2是在Dasatinib的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上優(yōu)化改造，推測其與Ab1結(jié)合不會(huì)像Imatinib對蛋白結(jié)構(gòu)要求嚴(yán)格，因此本實(shí)驗(yàn)首先純化野生型(WT)及具有突變位點(diǎn)（Y253F及T315I）的Ab1

6、激酶區(qū)，利用Histone2B作為Ab1激酶的底物，結(jié)果顯示FB2在納摩爾水平能夠有效地抑制Ab1（WT及Y253F）激酶活性，而對T315I突變的Ab1無效。同時(shí)進(jìn)一步檢測了FB2對Src及Lyn的體外激酶活性抑制作用，結(jié)果顯示其對激酶活性的IC50值分別為1.37nmol/L和2.83nmol/L。
　　 此后，采用Ba/F3P210細(xì)胞系包括野生型及兩株具有突變位點(diǎn)Y253F及T315I的細(xì)胞觀察FB2對細(xì)胞增殖的影響。M

7、TT結(jié)果顯示，F(xiàn)B2明顯抑制Ba/F3P210WT及Y253F細(xì)胞（IC50分別為1.30nmol/L，2.56nmol/L）的生長，對Ba/F3P210T315I無效。另外，為進(jìn)一步探討FB2抗Imatinib耐藥的作用機(jī)制，對細(xì)胞內(nèi)Bcr-Ab1、c-Src和Lyn蛋白的磷酸化水平進(jìn)行檢測，結(jié)果與體外活性測定一致，F(xiàn)B2能夠明顯抑制Ba/F3P210WT及Y253F細(xì)胞Bcr-Ab1、c-Src和Lyn蛋白的自身磷酸化水平，但對Ba

8、/F3P210T315I細(xì)胞僅能抑制c-Src和Lyn蛋白活性。同時(shí)在對細(xì)胞周期的影響的研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)B2在納摩爾水平可使Ba/F3P210(WT、Y253F)細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯，將藥物濃度增加至微摩爾水平能增加Ba/F3P210T3151細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例。
　　 最后，通過尾靜脈注射不同類型CML細(xì)胞株建立白血病動(dòng)物模型評價(jià)FB2治療CML的作用。無藥物處理的對照組小鼠很快發(fā)展為白血病小鼠，生存期在27～75天，

9、FB2可以明顯延長包括K562敏感株、Lyn激酶過表達(dá)的K562/G7.0耐藥株、Ba/F3P210野生株及Imatinib耐藥Y253F點(diǎn)突變株，四種不同白血病小鼠模型的生存期，且具有良好的劑量效應(yīng)關(guān)系。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察周期均在三個(gè)月以上，F(xiàn)B2治療組動(dòng)物對藥物耐受性均較好，無體重下降現(xiàn)象出現(xiàn)，一定程度上反映了該藥毒副作用小的特點(diǎn)。
　　 綜上，F(xiàn)B2作為一種酪氨酸激酶抑制劑，具有明確的Bcr-Ab1及Src激酶抑制作用，可能成