嗜鐵鉤端螺旋菌Leptospirillum ferriphilum UBK03抗鎳基因的克隆及功能分析.pdf

1、UBK03來源于江西省“721鈾礦”沙洲礦區(qū)，是一株氧化能力極強(qiáng)的化能自養(yǎng)細(xì)菌，其生長最適pH為1.3-1.5，最適溫度為39-42℃，革蘭氏染色反應(yīng)陰性，菌體在幼齡期為弧形，老齡期為螺旋狀，有鞭毛，好氧。根據(jù)其16SrDNA序列(GenBank登錄號(hào)：DQ534052)分析，發(fā)現(xiàn)它屬于鉤端螺旋菌中的GroupⅡ即嗜鐵鉤端螺旋菌(Leptospirillumferriphilum)。利用該菌在培養(yǎng)過程中亞鐵離子的變化規(guī)律，分析了該菌對(duì)金

2、屬離子鎳、鈷、鋅、銅和鎘的抗性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌對(duì)金屬離子鎳的抗性最強(qiáng)。同時(shí)該菌對(duì)鋅及鈷離子也表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗性，而對(duì)鎘及銅離子的抗性較弱。 提取嗜鐵鉤端螺旋菌UBK03的基因組DNA，構(gòu)建基因組文庫，從中篩選出一段能產(chǎn)生鎳抗性的DNA序列(GenBank登錄號(hào)DQ517331)。該段序列共有3991bp，命名為nr21，利用計(jì)算機(jī)分析發(fā)現(xiàn)這段序列中可能編碼四個(gè)和鎳抗性有關(guān)的基因分別命名為ncrA，ncrB，ncrC及ncrY,同時(shí)

3、還可能編碼三個(gè)啟動(dòng)子，即p1，p2及p3。采用進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)該菌株編碼的抗鎳系統(tǒng)是一種由MFS蛋白家族介導(dǎo)的抗鎳系統(tǒng)，而該菌是繼Klebsiellaoxytoca及Hafniaalvei5-5之后發(fā)現(xiàn)的第三種含有該類抗鎳系統(tǒng)的菌。 為了分析驗(yàn)證克隆序列中編碼的四個(gè)基因的功能，分別制作了pNR21中四個(gè)基因(ncrA，ncrB，ncrC及ncrY)的插入突變(pNTA，pNTB，pNTC及pNTY)及刪除突變(pNDA，pNDB

4、，pNDC及pNDY)。然后分別分析了含有該突變質(zhì)粒的菌株對(duì)鎳的抗性，發(fā)現(xiàn)這四個(gè)基因的性質(zhì)是不同的。其中ncrA，ncrB及ncrC為結(jié)構(gòu)基因，這三個(gè)基因中任意一個(gè)突變都會(huì)抑制含有該突變體質(zhì)粒菌株的抗鎳能力。而基因ncrY的作用正好相反，它編碼一個(gè)能對(duì)整個(gè)抗鎳系統(tǒng)起到負(fù)作用的因子，該基因的突變會(huì)使含有該突變質(zhì)粒的菌株的鎳抗性能力提高。 通過測(cè)定比較同一種菌(含有質(zhì)粒pNR21或pNCRABC)在經(jīng)過鎳誘導(dǎo)及不誘導(dǎo)時(shí)的生長曲線，

5、發(fā)現(xiàn)未誘導(dǎo)菌比經(jīng)過誘導(dǎo)菌的生長至少延遲一個(gè)小時(shí)，因此從中可以發(fā)現(xiàn)克隆序列中編碼的抗鎳系統(tǒng)是由鎳誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生的，也說明在質(zhì)粒pNR21或pNCRABC上至少編碼了一個(gè)和鎳的誘導(dǎo)有關(guān)的蛋白。 將連有啟動(dòng)子的序列片段連在報(bào)告基因lacZ的上游，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)的啟動(dòng)子p1及p2能組成型啟動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá)，而當(dāng)抗鎳系統(tǒng)(由質(zhì)粒pNCRABC編碼)和p1-lcZ,p2-lacZ同時(shí)存在時(shí)這兩個(gè)啟動(dòng)子(p1及p2)的啟動(dòng)類型則由組成型轉(zhuǎn)變?yōu)檎T導(dǎo)型

6、，其中鎳是啟動(dòng)的誘導(dǎo)劑。而啟動(dòng)子p3只有在整個(gè)抗鎳系統(tǒng)存在時(shí)才能發(fā)揮作用，且是由鎳誘導(dǎo)表達(dá)的。當(dāng)缺少抗鎳系統(tǒng)中任一成份，啟動(dòng)子p3不能啟動(dòng)。 為了分離和鎳誘導(dǎo)有關(guān)的蛋白，分別將連有啟動(dòng)子-報(bào)告基因的質(zhì)粒與含有插入突變的質(zhì)粒pNTA，pNTB及pNTC共轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，發(fā)現(xiàn)只有當(dāng)ncrB基因突變后，啟動(dòng)子p1及p2的表達(dá)類型才能從誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)變?yōu)榻M成型。該結(jié)果表明基因ncrB的編碼產(chǎn)物有可能是與鎳誘導(dǎo)有關(guān)，它能阻遏啟動(dòng)子p1