廣州淋病奈瑟菌基因gyrA、parC突變及其多抗原序列分型與環(huán)丙沙星耐藥相關(guān)性研究.pdf

1、淋病是指由淋病奈瑟球菌(淋球菌)感染所引起的一種性傳播疾病，是全球主要性傳播疾病之一，目前在細(xì)菌性性傳播感染性疾病中流行率排第二。近年來(lái)，淋病患者的數(shù)量一直處于上升趨勢(shì)。并且在抗生素選擇性壓力的作用下，以及淋球菌的高度易變性，導(dǎo)致淋病奈瑟菌耐藥株正逐漸增多，使得臨床上淋病治療失敗的情況日益嚴(yán)重。在90年代早期，首先出現(xiàn)了淋球菌對(duì)青霉素及四環(huán)素的耐藥，近年來(lái)，喹諾酮類(lèi)藥物也逐漸出現(xiàn)高度耐藥從而使其不再作為淋病治療的一線藥物。目前首選第三代

2、頭孢菌素作為臨床上治療淋病的一線藥物。
　　淋球菌對(duì)抗生素的耐藥有多種機(jī)制，如由質(zhì)粒和染色體介導(dǎo)的對(duì)青霉素以及四環(huán)素類(lèi)藥物的耐藥；由基因突變介導(dǎo)的對(duì)喹喏酮類(lèi)以及頭孢菌素類(lèi)藥物的耐藥；以及由主動(dòng)外排系統(tǒng)介導(dǎo)的多重耐藥等。目前認(rèn)為淋球菌對(duì)喹喏酮類(lèi)藥物的耐藥機(jī)制，主要是由于淋球菌上喹喏酮耐藥性決定區(qū)（Quinolone resistance determining region，QRDR）中 gyrA和 parC基因的突變導(dǎo)致，而且研究

3、表明淋球菌喹諾酮類(lèi)耐藥株(quinolong-resistant Neisseria gonorrhoeae，QRNG)對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥水平與gyrA和parC基因突變的數(shù)量和位點(diǎn)有關(guān)，淋球菌在gyrA基因突變位點(diǎn)較為穩(wěn)定，但在不同國(guó)家和地區(qū)，環(huán)丙沙星淋球菌耐藥株的靶基因特別是高水平耐藥株parC基因的突變位點(diǎn)和數(shù)量呈現(xiàn)多樣性。
　　2012年，英國(guó)有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，由于淋球菌對(duì)頭孢克肟耐藥，改用頭孢曲松鈉和阿奇霉素聯(lián)合治療淋病一年

4、后，對(duì)頭孢克肟欠敏感的淋病分離株比例快速下降，而這種下降與換藥具有明顯的相關(guān)性。因此，臨床上在棄用環(huán)丙沙星治療淋病數(shù)年后，淋球菌對(duì)環(huán)丙沙星的敏感性及耐藥機(jī)制是否出現(xiàn)變化，對(duì)淋病的臨床治療與流行病學(xué)監(jiān)測(cè)均有重要的意義。
　　目的:
　　本研究以2014年廣州地區(qū)97株淋球菌為研究對(duì)象，對(duì)其最小抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）值進(jìn)行監(jiān)測(cè)，分析了解2014年廣州地區(qū)淋球菌耐藥情況

5、；同時(shí)對(duì)比耐環(huán)丙沙星淋球菌的gyrA、parC基因突變情況，明確廣州地區(qū)耐環(huán)丙沙星淋球菌 gyrA、parC基因變異情況；另外將其耐藥菌株與淋球菌多抗原序列分型（Neisseria gonorrhoeae multiple antigen sequence typing，NG-MAST）相結(jié)合，以求通過(guò)對(duì)淋球菌NG-MAST分型，獲取廣州地區(qū)淋球菌ST型別，探究其和喹喏酮類(lèi)藥物耐藥之間的相關(guān)性。
　　方法:
　　收集2014

6、年1~12月淋球菌臨床分離株97株（來(lái)自男性患者58株，女性患者39株），傳代1次，通過(guò)稀釋、配比、培養(yǎng)記錄97株淋球菌對(duì)青霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、頭孢曲松、大觀霉素的敏感度并篩選出耐環(huán)丙沙星淋球菌菌株；提取耐藥菌株DNA，對(duì)gyrA、parC基因以及NG-MAST分型基因tbpB、porB基因行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增其目的片段并進(jìn)行雙向DNA測(cè)序驗(yàn)證分析；進(jìn)入NG-MAST網(wǎng)站對(duì)耐環(huán)丙沙星淋球菌菌株進(jìn)行淋球菌多抗原序列分型并得出

7、不同的ST型；同時(shí)利用MEGA軟件，使用UPGMA法分析得出進(jìn)化樹(shù)；采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算淋球菌對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥及高水平耐藥是否與gyrA、parC基因相關(guān)，NG-MAST進(jìn)化樹(shù)分群是否與淋球菌耐藥性相關(guān)。
　　結(jié)果:
　　1.97株淋病奈瑟菌臨床分離株中，環(huán)丙沙星耐藥率為97.9％（95/97），高水平耐藥率為42.3%(41/97)。MIC50為8 mg/L，MIC90為16 mg/L，無(wú)環(huán)丙沙星

8、敏感株。
　　2.95株耐環(huán)丙沙星淋球菌菌株均出現(xiàn)了gyrA基因91、95位點(diǎn)的雙重突變；其中93株同時(shí)出現(xiàn)parC基因的多位點(diǎn)突變，包括41株高水平耐藥株和52株中低水平耐藥株，突變位點(diǎn)包括85、86、87、91、104、129、131、138。
　　3.95株耐環(huán)丙沙星淋球菌中，parC基因87位點(diǎn)突變分別占高水平耐藥株和低水平耐藥株的85.4%（35/41）、59.3%（32/54），經(jīng)χ2檢驗(yàn)，χ2=7.64，P=0

9、.006＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4.耐環(huán)丙沙星淋球菌經(jīng)NG-MAST分型，50株淋球菌為網(wǎng)站已編號(hào)型別，分為35個(gè)不同的ST型，其中10個(gè)ST型含有2~4個(gè)不同的分離株。含分離株最多的ST型為ST5309（n=4），其次為ST2318（n=3），ST2083（n=3），余ST5062、ST7153、ST3435、ST7856、ST10207、ST9652、ST2268分別有2個(gè)分離株，其他ST型均只有1株。另在96個(gè)ST型

10、別中有46個(gè)尚未編號(hào)的新型別，占47.9%。
　　5.利用MEGA軟件，使用UPGMA法對(duì)淋球菌臨床分離株進(jìn)行系統(tǒng)樹(shù)分析，淋球菌流行株可分為兩大群，第一大群中MIC≥16 mg/L的菌株數(shù)占46.4%（39/84），第二大群12株臨床分離株中，除1株MIC值為16 mg/L外（8.3%，1/12），其余菌株MIC值均≤4mg/L，兩群高度耐藥菌株比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.27，P=0.012）。
　　結(jié)論: