SPNS2基因的克隆及其參與眼瞼發(fā)育機(jī)制的研究.pdf

1、我們實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)了一種綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因大鼠，部分轉(zhuǎn)基因大鼠出現(xiàn)EOB（eye-open at birth）表型，即出生時(shí)動(dòng)物眼瞼是睜開(kāi)狀態(tài)。通過(guò)反向PCR的方法發(fā)現(xiàn)是SPNS2（spinster homolog2）基因發(fā)生突變。SPNS2是S1P（sphingosine1-phosphate，1-磷酸鞘氨醇）的一種轉(zhuǎn)運(yùn)體，可以將S1P轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外。S1P通過(guò)和細(xì)胞表面的五種S1P受體（S1PReceptors,S1PRs）結(jié)合，啟動(dòng)下游

2、信號(hào)通路，引發(fā)細(xì)胞的增殖、分化和遷移等生理活動(dòng)。
　　哺乳動(dòng)物胚胎眼瞼在發(fā)育中經(jīng)歷一個(gè)閉合以及隨后再睜開(kāi)的過(guò)程。大鼠和小鼠眼瞼發(fā)育的表現(xiàn)為：胚胎發(fā)育后期，眼瞼閉合；動(dòng)物出生時(shí)眼瞼依然閉合，直到出生后2周左右眼瞼重新睜開(kāi)。如果眼瞼閉合發(fā)生障礙，便會(huì)出現(xiàn)EOB表型。目前研究發(fā)現(xiàn)有幾個(gè)重要的信號(hào)通路參與眼瞼發(fā)育過(guò)程，然而目前SPNS2影響眼瞼發(fā)育的分子機(jī)制并不清楚。本研究用出現(xiàn)EOB表型的大鼠作為動(dòng)物模型，研究SPNS2在眼瞼發(fā)育中的作

3、用機(jī)制；取得的主要研究結(jié)果如下：
　　1)通過(guò)系統(tǒng)的交配，我們發(fā)現(xiàn)，EOB表型是一種與綠色熒光蛋白連鎖的可遺傳的性狀，并且符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律。通過(guò)反向PCR的方法定位了轉(zhuǎn)基因載體pCX-EGFP的插入位點(diǎn)，并且用Southern blot驗(yàn)證了轉(zhuǎn)基因載體在轉(zhuǎn)基因大鼠中只有一個(gè)插入位點(diǎn)。通過(guò)序列分析，發(fā)現(xiàn)插入位點(diǎn)附近有一個(gè)基因：SPNS2。轉(zhuǎn)基因載體插入到SPNS2的第一個(gè)內(nèi)含子中，破壞了SPNS2的基因結(jié)構(gòu)。RT-PCR的結(jié)果顯示

4、在EOB大鼠中，SPNS2沒(méi)有表達(dá)。因此，我們建立唯一的大鼠SPNS2突變模型和大鼠EOB模型。
　　2)通過(guò)組織石蠟切片和原位雜交我們發(fā)現(xiàn)SPNS2在眼瞼上皮細(xì)胞中表達(dá)，SPNS2-/-大鼠眼瞼不能形成Leading Edge。孕鼠羊水中給予SPNS2的表達(dá)載體能夠挽救EOB，SPNS2的突變是導(dǎo)致EOB出現(xiàn)的原因。
　　3)孕鼠羊水中給予S1P和生長(zhǎng)因子，都能夠不同程度的挽救EOB表型；并且發(fā)現(xiàn)在WT和SPNS2-/-大

5、鼠中EGFR（epidermal growth factor receptor，表皮生長(zhǎng)因子受體）信號(hào)通路活化程度不同，證明了EGFR信號(hào)通路參與SPNS2的信號(hào)通路。采用體外培養(yǎng)皮膚角質(zhì)細(xì)胞的方法發(fā)現(xiàn)S1P可以激活EGFR的下游分子Erk1/2、c-Jun；EGFR和S1PR的阻斷劑實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)EGFR阻斷劑可以阻斷S1P對(duì)EGFR信號(hào)同路的激活，證明了S1P通過(guò)S1PR2-3反式激活EGFR信號(hào)通路。
　　4)通過(guò)金屬蛋白酶抑制

6、劑阻斷實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：Adam10的抑制劑阻斷了S1P對(duì)EGFR信號(hào)通路的激活。酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)顯示：Adam17的酶活性在眼瞼發(fā)育時(shí)期SPNS2-/-動(dòng)物中低于野生型，證明了Adam10和Adam17都參與了S1PR對(duì)EGFR的反式激活過(guò)程。免疫組化和Western Blot實(shí)驗(yàn)顯示調(diào)節(jié)Adam10/17活性的Timp3的表達(dá)量在SPNS2-/-大鼠中高于野生型，證明Timp3參與到SPNS2影響眼瞼發(fā)育過(guò)程中。
　　綜合以上結(jié)果，我們

7、可以推測(cè)SPNS2在眼瞼發(fā)育過(guò)程中的機(jī)制：SPNS2轉(zhuǎn)運(yùn)S1P到細(xì)胞外，S1P和細(xì)胞膜上的S1PR2和S1PR3結(jié)合，激活G蛋白，進(jìn)而調(diào)節(jié)Adam10/17的酶活性，剪切HB-EGF等生長(zhǎng)因子。生長(zhǎng)因子和細(xì)胞表面的EGFR結(jié)合，激活EGFR信號(hào)通路，活化下游的ERK1/2、c-Jun等分子，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞分裂、遷移等生理活動(dòng)，使眼瞼上皮細(xì)胞增殖遷移，最終上下眼瞼閉合。在SPNS2-/-大鼠中，SPNS2的轉(zhuǎn)運(yùn)功能被破壞，S1P不能分