CCSD(Spns2)基因的功能研究.pdf

1、S1P（Sphingosine-1-phosphate）是一種膜磷脂類分解和代謝產(chǎn)物，在許多生理功能中發(fā)揮重要作用。S1P既可作為細(xì)胞內(nèi)第二信使，又可通過 S1P轉(zhuǎn)運體轉(zhuǎn)運到細(xì)胞外，與細(xì)胞膜上的S1P受體結(jié)合，再作用于下游信號，產(chǎn)生一系列的生理學(xué)效應(yīng)。研究表明Spns2(spinster homologue2)參與S1P的轉(zhuǎn)運，在斑馬魚心肌前體細(xì)胞的遷移中發(fā)揮重要作用，Spns2基因突變會導(dǎo)致斑馬魚出現(xiàn)兩個心臟；同時S1P也會在免疫細(xì)胞

2、遷移過程中具有重要作用，Spns2-/-造成循環(huán)中S1P濃度顯著下降，從而導(dǎo)致成熟的T、B淋巴細(xì)胞無法遷入到外周循環(huán)和外周淋巴器官中。
　　在實驗過程中發(fā)現(xiàn)從日本靜岡SLC公司引進(jìn)的SD-Tg(CAG-EGFP)轉(zhuǎn)基因大鼠（綠大鼠）的 EGFP純合子動物出現(xiàn)以眼部癥狀為主的異常表型，并且呈隱性方式遺傳。據(jù)此推測 EGFP純合子轉(zhuǎn)基因大鼠所出現(xiàn)的表型可能由于宿主細(xì)胞基因組上的某個基因被 EGFP基因插入突變所致。由于 EGFP純合子

3、轉(zhuǎn)基因大鼠的角膜對外界刺激缺乏感知，于是暫時將該內(nèi)源性突變基因命名為 CCSD，即 Congenital Corneal Sensory Defect（先天性角膜感覺缺失）。為了分析 EGFP純合子轉(zhuǎn)基因（CCSDegfp/egfp）大鼠眼部癥狀異常表現(xiàn)的原因，進(jìn)而闡明CCSD基因的功能，本課題進(jìn)行了如下的研究工作：
　　1.首先針對 CCSDegfp/egfp大鼠進(jìn)行表型分析和CCSD基因在染色體中的定位。研究發(fā)現(xiàn)：(1)CCS

4、Degfp/egfp大鼠除了角膜對外界刺激缺乏感知外，還出現(xiàn)角膜混濁、瞼球粘連等異常表型；同時新生CCSDegfp/egfp大鼠發(fā)生EOB（eye-open at birth）；對動物眼球行石蠟切片，HE染色結(jié)果顯示CCSDegfp/egfp動物與WT和CCSD+/egfp動物相比：角膜上皮細(xì)胞層增厚，基質(zhì)層有炎性細(xì)胞；視網(wǎng)膜分層紊亂，外核層尤為明顯。（2）利用巢式PCR，獲得了CCSD在基因組插入位點的側(cè)翼序列，將序列進(jìn)行Blast比

5、對，比對結(jié)果顯示CCSD基因與大鼠的Spns2基因為同一基因。Spns2基因定位于大鼠第10號染色體上，而EGFP插入到它的第一個內(nèi)含子中，從而造成其無法轉(zhuǎn)錄。以上研究表明，CCSD基因的插入突變造成了EGFP純合子轉(zhuǎn)基因大鼠—CCSDegfp/egfp異常表型。染色體定位研究發(fā)現(xiàn)EGFP插入內(nèi)源性Spns2基因，造成Spns2基因的表達(dá)缺失。因此，CCSD基因和Spns2基因很可能為同一基因。提示CCSDegfp/egfp大鼠所產(chǎn)生的

6、異常表型，可能是由于Spns2突變造成的。
　　2.進(jìn)一步對 CCSDegfp/egfp的表型和已報道的Spns2-/-的小鼠表型進(jìn)行了對比。首先對CCSDegfp/egfp大鼠外周血中的免疫細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)CCSDegfp/egfp大鼠外周血中，白細(xì)胞數(shù)量和T、B淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯減少。該表型與Spns2-/-小鼠表型一致，結(jié)果進(jìn)一步確定CCSD和Spns2為同一基因；其次構(gòu)建Spns2-EGFP融合蛋白表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)

7、染Hela細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Spns2明顯表達(dá)于細(xì)胞膜上；最后通過合成Spns2蛋白N-端和C-端兩條多肽，分別免疫新西蘭大白兔，建立兩株抗-Spns2多克隆抗體：S2(N)和S2(C)。并且這兩株抗體可以特異性的識別Spns2蛋白。部分胚胎組織染色顯示Spns2在外周血細(xì)胞、肝細(xì)胞及外周神經(jīng)節(jié)中表達(dá)。
　　3.關(guān)于Spns2基因缺陷對免疫系統(tǒng)之外的表型影響還不明確，CCSDegfp/egfp大鼠的EOB表型在Spns2-/-小鼠中雖

8、已有報道，但對其產(chǎn)生機(jī)制未作進(jìn)一步的研究。所以針對大鼠中發(fā)現(xiàn)的這一表型及其分子機(jī)制進(jìn)一步深入研究。利用組織學(xué)染色、細(xì)胞培養(yǎng)、免疫熒光染色和Western blot等方法研究CCSDegfp/egfp大鼠的EOB表型及產(chǎn)生的分子機(jī)制。研究中發(fā)現(xiàn)：（1）CCSDegfp/egfp大鼠眼瞼緣不能像WT和CCSD+/egfp大鼠那樣正常遷出和融合；（2）Spns2表達(dá)在WT和CCSD+/egfp大鼠眼瞼前緣上，而在CCSDegfp/egfp大鼠

9、眼睛前緣則沒有表達(dá)；（3）Spns2功能缺失可能是通過降低EGFR磷酸化水平，同時通過MEKK1和c-Jun等細(xì)胞內(nèi)信號途徑，造成CCSDegfp/egfp大鼠EOB表型。
　　綜上所述，本課題研究中所發(fā)現(xiàn)的CCSD基因與Spns2為同一基因，證實了先前宿主細(xì)胞基因組上的某個基因被EGFP基因插入突變所致的推測。且通過對CCSDegfp/egfp大鼠EOB表型的研究揭示Spns2除了在免疫系統(tǒng)的功能外，還可以通過干預(yù)皮膚角質(zhì)細(xì)胞骨