中性粒細胞胞外捕網促足細胞自噬的機制及鹽酸青藤堿的干預效應.pdf

1、目的：
　　足細胞(podocyte)是一種終末分化的臟層上皮細胞，通過交錯形成的足突與內皮細胞、基底膜共同構成腎小球濾過屏障。當足細胞暴露于多種損傷因素，可引起活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)水平升高，從而導致胞內蛋白及DNA損傷。足細胞在維持腎臟有效濾過屏障中發(fā)揮至關重要的作用，是多種腎小球疾病損傷的中心環(huán)節(jié)。
　　足細胞在腎臟炎癥反應中能夠招募循環(huán)中的中性粒細胞至炎癥區(qū)域發(fā)揮免疫監(jiān)視和

2、炎癥保護作用。在炎癥過程中，中性粒細胞本身能夠分泌多種細胞因子、趨化因子及調節(jié)分子，從而激活更多中性粒細胞活化并募集循環(huán)中其它免疫細胞。中性粒細胞胞外捕網（neutrophil extracellular traps，NETs）是新近發(fā)現的一種中性粒細胞活化并釋放大量溶菌酶及染色質纖維等自身組分，從而產生殺菌及免疫效應的新形式。NETs過度形成或清除障礙導致大量自身組分暴露于免疫監(jiān)視，并作為內源性危險信號打破自身免疫耐受，成為多種腎臟疾

3、病的研究熱點。
　　自噬是一種維持細胞自身內環(huán)境穩(wěn)定的保護性機制，通過處理并回收胞內損傷蛋白或細胞器，以應對細胞所處的各種不利因素。然而，過度自噬將導致細胞死亡。足細胞本身表現出較高的基礎自噬水平。近來發(fā)現ROS是細胞受到各種刺激因素發(fā)揮作用的“交匯點”，作為主要的細胞內信號傳感器維持自噬，啟動自噬小體形成并調節(jié)自噬過程，是自噬調節(jié)的上游分子。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX)是細胞ROS產生的兩大主要來源之一。NOX是位于

4、細胞膜上的復合酶，由多種催化亞基和調節(jié)亞基組成，其中p47-phox是主要調節(jié)亞基，能夠定位在細胞膜并整合其它亞基，在NOX全酶激活中起到重要作用。腎素-血管緊張素系統(tǒng)在腎臟的病理生理發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)是其主要的效應分子，足細胞上既表達AngⅡ受體，也能分泌AngⅡ。鹽酸青藤堿(SN)是一種具有抗炎、免疫調節(jié)的生物堿，新近發(fā)現SN能夠通過降低神經小膠質細胞ROS水平發(fā)揮神經保護作用

5、。
　　基于上述研究，我們通過觀察NETs對足細胞AngⅡ分泌的影響及AngⅡ對足細胞自噬的影響，探討SN通過抑制ROS途徑干預AngⅡ誘導的足細胞自噬的可能機制，進一步明確NETs在腎臟炎癥中對足細胞的損傷機制及SN可能的腎臟保護作用。
　　方法：
　　1.采用小鼠瓊脂糖明膠皮下埋植法獲取大量具有自發(fā)NETs傾向的中性粒細胞。人條件永生化足細胞(AB8/13)和鼠足細胞培養(yǎng)。
　　2.采用免疫熒光觀察中性粒細胞

6、形態(tài)和NETs形成情況，以及p47-phox亞基在細胞膜表達情況。
　　3.流式細胞術鑒定所分離中性粒細胞純度及測定足細胞ROS水平。
　　4.ELISA檢測NETs與足細胞共培養(yǎng)后上清的AngⅡ濃度
　　5.采用Western blot檢測足細胞LC3B總蛋白、p47-phox膜蛋白表達水平。
　　6.透射電鏡觀察足細胞自噬體形成。
　　結果：
　　1.皮下埋植瓊脂糖明膠能夠獲取大量高純度（達95.

7、7％）、具有自發(fā)NETs傾向的中性粒細胞。
　　2.NETs能夠增加足細胞AngⅡ分泌(p=0.027)。
　　3.SN能夠減少中性粒細胞NETs形成(p=0.002)。
　　4.SN本身不會增加足細胞LC3B蛋白比例，不影響自噬水平(p＞0.05)。
　　5.AngⅡ刺激后足細胞LC3B蛋白比例明顯增加（*P＜0.05），透射電鏡下觀察自噬小體數量明顯增加（P＜0.001）。SN干預后LC3B蛋白比例和自噬小體

8、數量均降低（分別為P＜0.05和P＜0.001）
　　6.AngⅡ能夠顯著增加足細胞ROS生成(P＜0.01)。經不同濃度的SN(10-8～10-4 M)干預后ROS水平較AngⅡ刺激組顯著下降（P＜0.05、P＜0.01）。
　　7.AngⅡ能顯著增加足細胞p47-phox在細胞膜上表達，不同濃度的SN(10-8～10-4M)預處理后能抑制其表達(P＜0.001)。
　　結論：
　　1.皮下埋植瓊脂糖明膠法可獲