依賴于環(huán)指蛋白8的人DNA聚合酶δ體外泛素化反應探討.pdf

1、在真核生物B-家族三種主要DNA聚合酶（Polα、Polδ和Polε）中，Polδ是最重要的一種復制性聚合酶，除了在染色體 DN A復制過程中起重要作用外，它還參與多種形式的DN A損傷修復過程，在維持細胞周期的正常調(diào)節(jié)以保證基因組結構的完整性和遺傳穩(wěn)定性方面具有特殊的重要意義。人源 DN A聚合酶δ是由四個亞基組成的異源四聚體：催化大亞基p125、小亞基p50、以及另外兩個輔助亞基p68和p12。前期的研究發(fā)現(xiàn)，在損傷試劑處理或射線誘

2、導而引起 DN A損傷的情況下，最小亞基p12在ATR/Chk1通路調(diào)控下以泛素化依賴（ubiquitinylation-dependent）的形式經(jīng)蛋白酶體降解，從而導致細胞內(nèi)Polδ由原來的四聚體形式Po lδ4轉換為三聚體Po lδ3以應對DN A損傷，并可能在隨后的修復過程中起著重要作用。
　　研究表明，p12的降解可能受到多種E3介導的多泛素化途徑的調(diào)控，但截止到目前，僅鑒定出兩種E3連接酶，環(huán)指蛋白8（Ring Fin

3、ger Protein8, RNF8）和CRL4Cdt2，它們均介導了以 p12為靶標的多泛素化修飾。有報道指出，p68亞基在體內(nèi)也能夠被泛素化和類泛素化修飾，但在應對DNA損傷的過程中，Polδ究竟有多少亞基、具體哪個亞基、被何種E2/E3系統(tǒng)所介導、是發(fā)生多泛素還是單泛素修飾等的詳細機制均不是很清楚。
　　幾乎所有主要的DN A修復途徑、損傷避免機制和細胞周期檢查點響應等過程都或多或少的受到泛素化和（或）類泛素化 SUMO修飾

4、途徑的調(diào)控。泛素化和 SUMO參與多種 DNA的修復過程，如跨損傷合成（Translesion Synthesis）、核苷酸切除（Nucleotide Excision）、同源重組（Homologous Recombination）等?；诜核鼗揎椩诟鞣NDNA損傷修復途徑中的重要作用，本論文研究擬對Polδ的四個亞基分別進行體外泛素化分析，為揭示Polδ的泛素化修飾在DN A損傷應答過程中的未知功能提供參考。
　　本研究應用昆蟲

5、-桿狀病毒表達系統(tǒng)，通過制備具 E3連接酶活性的RNF8，結合外購的多種E2綴合酶，對Po lδ的四個亞基分別進行泛素化修飾的體外分析；同時通過外購的E2/E3系統(tǒng)-RAD6/RAD18，對Polδ各亞基也進行了初步的泛素化體外分析。結果表明，RNF8既可介導p50單泛素化修飾，又可介導p12亞基的多泛素化修飾，但不能介導p125亞基的泛素化。RAD6/RAD18作為E2/E3酶，在DN A基質(zhì)的存在下，能夠介導p50的泛素化修飾，類似