依賴于氧化脫甲氧基的黃脂菌素xanthone環(huán)的生物合成研究.pdf

1、黃脂菌素具有高度氧化且呈角狀折疊排列的六環(huán)骨架和核心的xanthone環(huán)，屬于聚環(huán)xanthone類化合物。黃脂菌素具有良好的抗細(xì)菌、抗真菌及抗腫瘤活性，其藥效基團(tuán)xanthone環(huán)的生物合成機(jī)制是聚環(huán)xanthone類抗生素生物合成研究中的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題。前期已經(jīng)克隆了黃脂菌素的生物合成基因簇，并初步預(yù)測(cè)了黃脂菌素的生物合成途徑。然而，黃脂菌素核心結(jié)構(gòu)xanthone環(huán)的形成以及多種后修飾的酶學(xué)機(jī)制尚未解析。本論文針對(duì)核心xanthon

2、e環(huán)形成和甲基化、氯代、氧化等后修飾過(guò)程展開(kāi)研究，以期完善對(duì)黃脂菌素生物合成途徑的認(rèn)識(shí)，并為獲得更高活性的黃脂菌素衍生物提供理論依據(jù)。
　　首先，研究了核心結(jié)構(gòu)xanthone環(huán)的生物合成機(jī)制。本研究中以?xanO4突變株積累的蒽醌化合物5為底物，成功實(shí)現(xiàn)了由Baeyer-Villiger單加氧酶XanO4催化的xanthone環(huán)的體外重建。利用同位素標(biāo)記的氧氣，揭示了XanO4催化xanthone環(huán)的形成涉及到連續(xù)兩個(gè)氧原子的插

3、入，發(fā)生氧原子對(duì)底物蒽醌分子中羰基基團(tuán)和甲氧基基團(tuán)的氧化替換，伴隨著一個(gè)新穎的脫甲氧基反應(yīng)。另外，對(duì)Xa nO4同源蛋白Arx30的生化活性分析，證實(shí)了XanO4催化xanthone環(huán)形成反應(yīng)在同類化合物生物合成過(guò)程中的普遍性。
　　基于序列比對(duì)分析，構(gòu)建了XanO4和Arx30蛋白中第45位精氨酸（R45）的定點(diǎn)突變體XanO4R45A和ARX30R45A，體外酶學(xué)活性實(shí)驗(yàn)證實(shí)了R45對(duì)于xanthone環(huán)形成的必要性；突變體蛋

4、白對(duì)化合物5的酶學(xué)轉(zhuǎn)化獲得了C17位脫甲基的蒽醌類似物（化合物5f）；XanO4和Arx30對(duì)5f的酶學(xué)活性分析證明了化合物5中C17位甲氧基對(duì)xanthone環(huán)形成的必要性。
　　C17位羥基上的甲基是黃脂菌素分子結(jié)構(gòu)中形成亞甲基雙氧橋結(jié)構(gòu)域所必需的，然而XanO4催化化合物5中C17位脫甲氧基反應(yīng)的同時(shí)向反應(yīng)產(chǎn)物化合物12中引入了一個(gè)新的羥基基團(tuán)。這就暗示著在黃脂菌素生物合成過(guò)程中存在一步隱藏的C17位羥基的再次甲基化。本研究

5、利用遺傳學(xué)和生物化學(xué)的方法初步確定了黃脂菌素生物合成基因簇中三個(gè)氧甲基轉(zhuǎn)移酶的功能：Xa nM1負(fù)責(zé)黃脂菌素生物合成早期化合物5的前體分子中C17位羥基的甲基化；XanM2負(fù)責(zé)xanthone環(huán)形成之后﹑亞甲基雙氧橋形成之前，C13位羥基的甲基化；XanM3負(fù)責(zé)隱藏在xanthone環(huán)形成之后﹑氨基化之前，C17位羥基的再次甲基化。
　　最后，通過(guò)對(duì)黃脂菌素生物合成基因簇中唯一的氯代酶基因x anH的研究，證實(shí)了xanthone環(huán)

6、結(jié)構(gòu)單元和C17位甲氧基對(duì)氯代反應(yīng)的必要性。
　　總之，本論文系統(tǒng)研究了XanO4催化xanthone核心環(huán)形成的酶反應(yīng)，揭示了伴隨脫甲氧基化而實(shí)現(xiàn)環(huán)酮到環(huán)醚轉(zhuǎn)化的酶反應(yīng)機(jī)制，拓展了對(duì)天然產(chǎn)物生物合成中Baeyer-Villiger氧化反應(yīng)類型的認(rèn)識(shí)，為發(fā)展高效、綠色的xanthone結(jié)構(gòu)元件生物合成方法提供了范例。同時(shí)，對(duì)氧甲基轉(zhuǎn)移酶和氯代酶的研究，揭示了黃脂菌素生物合成過(guò)程中隱藏的一步轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)，證明了xanthone環(huán)和氧甲