鏈黑菌酮的生物合成機(jī)制和10′-去甲氧基鏈黑菌素的高效制備.pdf

1、鏈黑菌素（streptonigrin）是一種具有獨(dú)特的氨基喹啉醌結(jié)構(gòu)的抗生素，最早是從絨毛鏈霉菌（Streptomyce flocculus ATCC13257）的發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到。它和鏈黑菌酮（streptonigron）、淡紫醌霉素（lavendamycin）、10′-去甲氧基鏈黑菌素（10′-desmethoxystreptonigrin）等類似物合稱“streptonigrinoids”。這一家族的抗生素因具有較好的抗腫瘤、抗

2、病毒、抗細(xì)菌活性及獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)而受到廣泛關(guān)注。隨著鏈黑菌素生物合成基因簇的克隆和生物合成研究的深入，淡紫醌霉素、10′-去甲氧基鏈黑菌素都已經(jīng)被證實(shí)為鏈黑菌素生物合成的中間體。然而鏈黑菌酮的生物合成仍舊未知，推測(cè)鏈黑菌素經(jīng)過氧化脫羧生成鏈黑菌酮。
　　鏈黑菌酮的合成涉及鏈黑菌素吡啶環(huán)α位的脫羧和羥基化過程。根據(jù)推測(cè)，鏈黑菌素生物合成基因簇中的四個(gè)黃素單加氧酶基因編碼的蛋白之一可能參與了這一氧化脫羧過程，因此首先對(duì)這四個(gè)基因進(jìn)行了

3、敲除。然而對(duì)StnD、StnH2、StnH3、StnK1體外表征證實(shí)鏈黑菌素的氧化脫羧過程是由核黃素獨(dú)立催化完成，而并不涉及黃素單加氧酶的參與。
　　通過對(duì)反應(yīng)條件的優(yōu)化，確定了核黃素催化鏈黑菌素轉(zhuǎn)化為鏈黑菌酮的最適條件為：10μM的FAD、5 mM的NADH、2μM的flavin reductase、pH7.0-9.0、30?C下反應(yīng)10 min。研究發(fā)現(xiàn)FMN和Riboflavin也可以替代FAD催化鏈黑菌素的氧化脫羧生成鏈黑

4、菌酮，并且與FAD具有相似的轉(zhuǎn)化率。DTT作為還原劑取代flavin reductase/NADH還原體系時(shí)，反應(yīng)無論是在水溶液中還是在水-水溶性有機(jī)溶劑混合體系中都可以發(fā)生，但是反應(yīng)效率降低了一半。
　　在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下，F(xiàn)AD可以催化鏈黑菌素類似物包括10′-去甲氧基鏈黑菌素，6,10′-二去甲氧基鏈黑菌素，9′,10′-二去甲基鏈黑菌素，10′-去甲基鏈黑菌素發(fā)生氧化脫羧反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的鏈黑菌酮類似物。出乎意料的是，淡紫醌

5、霉素也能發(fā)生氧化脫羧反應(yīng)，生成相應(yīng)的酮類化合物。
　　鏈黑菌素類似物發(fā)生氧化脫羧反應(yīng)，暗示FAD催化的氧化脫羧反應(yīng)很可能只與它們結(jié)構(gòu)中的吡啶羧酸結(jié)構(gòu)有關(guān)。為了揭示FAD催化氧化脫羧反應(yīng)的化學(xué)機(jī)理，設(shè)計(jì)了一系列底物對(duì)反應(yīng)進(jìn)行系統(tǒng)考查。當(dāng)以3-羥基吡啶羧酸，3-氨基吡啶羧酸，5-氨基吡啶羧酸為底物時(shí)，發(fā)現(xiàn)它們都能被轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的吡啶酮產(chǎn)物；而以水楊酸，鄰氨基苯甲酸，4-氨基-水楊酸為底物，卻不能發(fā)生氧化脫羧生成相應(yīng)的酮類或酚類化合物；以

6、煙酸、2,3-吡啶二羧酸、3-硝基-2吡啶羧酸作為底物時(shí)同樣不能發(fā)生相應(yīng)反應(yīng)；3-氨基吡啶在標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)條件下，反應(yīng)也不能發(fā)生。以上研究表明，吡啶環(huán)上的供電子基團(tuán)及2-位羧基為反應(yīng)發(fā)生的必須基團(tuán)，暗示了FAD催化的氧化脫羧反應(yīng)可能經(jīng)歷了親電取代反應(yīng)過程，即FAD經(jīng)還原生成FADH2，F(xiàn)ADH2瞬間與氧氣反應(yīng)形成過氧化物 C4a-FIOOH，這個(gè)過氧化物親電進(jìn)攻吡啶環(huán)。
　　但是，由于過氧化物C4a-FIOOH極容易分解產(chǎn)生過氧化氫、

7、超氧自由基等具有氧化性的產(chǎn)物。本研究使用一系列不同濃度的過氧化氫、3-氯過氧苯甲酸、過氧叔丁醇作為氧化劑，發(fā)現(xiàn)無論反應(yīng)體系中是否含有 FAD，都不能將鏈黑菌素氧化成鏈黑菌酮，這說明鏈黑菌素的氧化脫羧與C4a-FIOOH分解產(chǎn)生的過氧化氫并無直接聯(lián)系。當(dāng)在反應(yīng)體系中加入自由基淬滅劑二甲基吡啶-N-氧化物和超氧化物歧化酶時(shí)，鏈黑菌酮的生成并沒有受到任何影響；另一方面，在黃嘌呤氧化酶和次黃嘌呤的反應(yīng)體系中加入鏈黑菌素，也沒有鏈黑菌酮的生成；在

8、反應(yīng)體系中加入超氧化鉀也沒有檢測(cè)到鏈黑菌酮的生成。這些研究排除了FAD催化鏈黑菌素的氧化脫羧反應(yīng)有超氧自由基或其他自由基的參與。
　　根據(jù)上述反應(yīng)結(jié)果，推測(cè)FAD催化富電子吡啶羧酸氧化脫羧的反應(yīng)機(jī)制可能為：FAD在NADH或者DTT存在的條件下，被還原成FADH2，隨后被空氣中的氧氣氧化成C4a-FIOOH。反應(yīng)起始于吡啶環(huán)上的供電子基團(tuán)，吡啶環(huán)上電子發(fā)生轉(zhuǎn)移，使得羧基鄰位雙鍵進(jìn)攻C4a-FIOOH，形成缺電子的σ復(fù)合物并在羧基的

9、β-位形成缺電子中心，然后經(jīng)過一個(gè)類似于β-酮酸式的脫羧反應(yīng)，產(chǎn)生了2-OH取代的吡啶，再通過互變異構(gòu)形成相應(yīng)的吡啶酮。
　　10′-去甲氧基鏈黑菌素作為“streptonigrinoids”家族的一員，最早從Streptomyce albus中分離得到，因其能有效地抑制ras原癌基因的p21蛋白的法尼基化而備受關(guān)注。它的毒性比鏈黑菌素小，活性卻比鏈黑菌素更高。但因它在其產(chǎn)生菌S. albus中的產(chǎn)量非常低，從而阻礙了對(duì)它的研究和

10、開發(fā)。本研究一方面，通過在絨毛鏈霉菌 CGMCC4.1223羧酯水解酶基因（stnA）缺失的突變株?stnA發(fā)酵過程中添加10%（w/v）的HP2MGL型大孔樹脂，來大量獲得10′-去甲氧基鏈黑菌素的前體10′-去甲氧基鏈黑菌素甲酯。另一方面，通過對(duì)水解酶StnA深入的研究，發(fā)現(xiàn)StnA具有較好的熱穩(wěn)定性和耐有機(jī)溶劑的特性。通過將StnA固定到重力型蛋白純化鎳柱上，使10′-去甲氧基鏈黑菌素甲酯溶液通過重力型蛋白柱，即可得到產(chǎn)物10′-