殺稻瘟菌素的異源表達及其生物合成機制的體內功能研究.pdf

1、殺稻瘟菌素是一類肽核苷類抗生素。自1958年被發(fā)現(xiàn)以來，它被大規(guī)模用于取代汞制劑農藥來防治稻瘟病、白粉病。此外，由于殺稻瘟菌素在真核生物基因工程中可以有效地篩選突變株，它被廣泛的應用于生物研究。殺稻瘟菌素的生物合成基因簇于2003年被報道，但是由于殺稻瘟菌素的天然產生菌的遺傳操作難以進行，幾乎沒有關于殺稻瘟菌素生物合成的體內研究的報道。因此目前報道的生物合成基因簇的完整性還有待商榷。我們通過構建殺稻瘟菌素天然產生菌 S. griseoc

2、hromogenes的基因組文庫，并結合已發(fā)表的序列，運用染色體步移技術從基因組文庫中釣取出了柯斯質粒7D11。測序結果表明，7D11包含了殺稻瘟菌素已發(fā)表的DNA序列及其下游的8.6 kb的片段。進一步的生物信息學分析結果顯示，這8.6 kb序列中所包含的基因與殺稻瘟菌素生物合成并無關聯(lián)。
　　為了深入研究殺稻瘟菌素的生物合成機制，我們通過4次同源重組的方法，將7D11中的插入序列嫁接到了變鉛青鏈霉菌S. lividans HX

3、Y16的染色體上，得到突變株S. lividans LL2。生測結果表明，LL2并不能對殺稻瘟菌素生測指示菌（紅酵母）產生明顯的抑制作用。進一步的發(fā)酵結果表明，突變株LL2發(fā)酵產物中包含了一種殺稻瘟菌素的衍生物‐去氨基羥化殺稻瘟菌素（deaminohydroxymildiomycin，OH‐BS）。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，在HXY16中的染色體存在一種可能的殺稻瘟菌素脫氨酶基因SLBSD。體外生化實驗表明，大腸桿菌融合表達的蛋白SLBSD可

4、以將殺稻瘟菌素轉化為OH‐BS。出人意料的是，融合表達的SLBSD在體外不僅可以以殺稻瘟菌素為底物，它還可以轉化另一種核苷類抗生素米多霉素以及殺稻瘟菌素合成的中間產物胞嘧啶葡萄糖醛酸（cytosylglucuronic acid，CGA）。而這兩個化合物被確認是可以在野生型變鉛青鏈霉菌中進行異源合成的。緊接著，我們在 HXY16中敲除 SLBSD后得到突變株S. lividans WJ1，其對于殺稻瘟菌素的抗性從大于200μg/ml下降

5、到了100μg/ml。體內和體外的實驗表明：SLBSD是天然存在于變鉛青鏈霉菌染色體上的一個殺稻瘟菌素抗性基因。
　　在嫁接有殺稻瘟菌素生物合成基因簇的菌株LL2中，我們通過敲除SLBSD得到突變株S. lividans WJ2。發(fā)酵結果顯示，在WJ2中OH‐BS不再產生，并且WJ2可以正常的異源表達殺稻瘟菌素。這個結果進一步證明了WJ2中包含了完整的殺稻瘟菌素生物合成基因簇。為了深入的檢測 WJ2中產生的次級代謝產物，以及亞鐵離

6、子對殺稻瘟菌素生物合成的影響，將WJ2在種子/發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵并用LC‐MS檢測發(fā)酵液。檢測結果表明，WJ2的發(fā)酵液中存在一個新的次級代謝產物。通過質譜以及二級質譜的分析，證實這個代謝產物為去甲基殺稻瘟菌素。
　　為了探究造成去甲基殺稻瘟菌素積累的原因，我們探索了已報道的殺稻瘟菌素生物合成基因簇。生物信息學分析揭示 blsL可能編碼一個N‐甲基轉移酶，因此推斷 blsL可能與去甲基殺稻瘟菌素的形成有關系?；蛑脫Q的結果表明，在

7、blsL的被壯觀霉素抗性基因置換的突變株變鉛青鏈霉菌WJ3中不再產生殺稻瘟菌素，并且大量積累去甲基殺稻瘟菌素。同時，blsL基因回補菌株可以正常產生殺稻瘟菌素，證實在WJ3中不存在極性效應。
　　在殺稻瘟菌素生物合成基因簇中，blsF的功能未知。通過 BlastP搜索發(fā)現(xiàn)，BlsF與米多霉素生物合成基因簇中MilL有一定同源性。但是milL并不是米多霉素生物合成的必需基因?；蛑脫Q的結果表明，在blsF被壯觀霉素抗性基因置換后的突

8、變株變鉛青鏈霉菌 WJ4中，殺稻瘟菌素的產量大大提高。不僅如此，在未經純化處理的WJ4的發(fā)酵液中還檢測到了大量殺稻瘟菌素生物合成中間體CGA，進一步表明blsF可能是殺稻瘟菌素生物合成中一個途徑專一行的調節(jié)基因。
　　在殺稻瘟菌素生物合成基因簇中，blsE編碼了一個Radical SAM家族的蛋白，其功能未知。為了開展BlsE的體外生化實驗，需要通過體內研究確定BlsE的底物?；蛑脫Q的結果表明，在用壯觀霉素抗性基因置換了blsE

9、的突變株變鉛青鏈霉菌 WJ5的發(fā)酵液中，殺稻瘟菌素不再產生，而殺稻瘟菌素生物合成的中間體 CGA得到了大量積累。在米多霉素生物合成途徑的研究中，blsE的同源基因milG的基因置換結果也得到了類似的結果。這證實了BlsE的底物為CGA，為之后BlsE的體外實驗打下了基礎。
　　最近的體外生化實驗表明，在殺稻瘟菌素生物合成中經歷了一個脫羧‐再羧化的過程。但是在之前對基因簇的分析中，并未找到與羧化相關的基因。深入分析發(fā)現(xiàn)，BlsI可能

10、是一個潛在的羧化酶。它與生物素羧化酶具有一定的同源性。基因置換的結果表明，在壯觀霉素置換了blsI的突變株變鉛青鏈霉菌 WJ6的發(fā)酵液中，殺稻瘟菌素不再產生，并且還檢測到了一個分子量為227的次級代謝產物。二級質譜分析表明，這個次級代謝產物包含了一個胞嘧啶結構，推測其為殺稻瘟菌素生物合成中的一個中間產物。這個實驗結果推翻了之前關于BlsI的功能的推測。
　　通過在變鉛青鏈霉菌中成功異源表達殺稻瘟菌素，我們得到了一株殺稻瘟菌素人工產