分枝狀PEI在不同細胞系效率和細胞毒性間的關(guān)系.pdf

1、背景：
　　基因治療能將外源正?；?qū)氚屑毎⑹怪行П磉_，從而達到治療目的，是一種新興的治療方法。聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI)是一種高效的非病毒性基因轉(zhuǎn)染載體，其枝狀復合物尤其是25 kDa的分支狀PEI有較高的基因轉(zhuǎn)染效率，它在基因傳遞領(lǐng)域的應(yīng)用非常廣泛。同時PEI對細胞也有毒副作用，它的毒性與相對分子質(zhì)量(Mr)有關(guān)，不同Mr或異構(gòu)體的PEI，在體內(nèi)介導基因轉(zhuǎn)染的效率和細胞毒性截然不同。本課題將在

2、不同的細胞系中研究其轉(zhuǎn)染效率和毒性間的關(guān)系，并嘗試探討其分子機制。
　　目的：
　　本研究擬確定PEI對不同細胞的轉(zhuǎn)染效率和細胞毒性之間的內(nèi)在聯(lián)系，同時優(yōu)化PEI基因轉(zhuǎn)染的條件，確定轉(zhuǎn)染時機及最優(yōu)用量，并分析PEI在BMSC細胞中可能的分子機制。
　　方法：
　　1.PEI在不同細胞系中基因轉(zhuǎn)染效率和細胞毒性之間的關(guān)系不同哺乳動物細胞系293T、Hela和BMSC細胞培養(yǎng)后，懸浮轉(zhuǎn)染pEGFP質(zhì)粒與PEI的復合物

3、，分別孵育24 h和48 h，利用熒光細胞計數(shù)法分析轉(zhuǎn)染效率;懸浮轉(zhuǎn)染pLuc(luciferase基因來自Renilla)質(zhì)粒與PEI的復合物，利用分光光度計分析各細胞的熒光素酶活性;采用MTT比色法分析PEI對293T、Hela和BMSC細胞的毒性，Western印跡檢測細胞毒性標記物一水解的(cleaved) PARP和水解的caspase-3，進而得出轉(zhuǎn)染效率和毒性之間的相關(guān)性。
　　2.PEI介導的BMSC細胞轉(zhuǎn)染可能的

4、分子機制
　　構(gòu)建caveolin-1過表達質(zhì)粒，經(jīng)PEI轉(zhuǎn)染BMSC細胞，Western印跡法檢測其對轉(zhuǎn)染效率和毒性的影響。
　　結(jié)果：
　　1.PEI對293T、Hela和BMSC3種細胞的細胞毒性和轉(zhuǎn)染效率呈正相關(guān)，即轉(zhuǎn)染效率越高，PEI的細胞毒性亦越高:
　?、贌晒馑孛富钚詸z測結(jié)果顯示PEI∶DNA(μg∶μg)的比率為2(4μg PEI∶2μgDNA)時，轉(zhuǎn)染效率最高。
　?、诓煌瑫r間點轉(zhuǎn)染的結(jié)果

5、表明轉(zhuǎn)染時間之間的差異不顯著。
　?、踦EGFP表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T、Hela和BMSC細胞的轉(zhuǎn)染效率結(jié)果是:92.1±4.5％，29.2±3.4％和21.5±2.1％。
　　④熒光素酶報告基因轉(zhuǎn)染293T、Hela和BMSC細胞后熒光素酶活性分別是:2.873×108、3.35×107、1.94×107 RLU/mg protein。
　?、軲TT法結(jié)果顯示PEI轉(zhuǎn)染pLuc DNA后死細胞百分比分別是66.1±2.