脂聯(lián)素及其受體在COPD疾病進展中的作用.pdf

1、慢性阻塞性肺疾?。–hronic obstructive pulmonary diseases，COPD）是一種常見的慢性氣道炎癥性疾病，嚴重危害人類健康。脂聯(lián)素（Adiponectin）是由脂肪細胞分泌一種重要的脂肪因子，在外周血循環(huán)中可見脂聯(lián)素的全長結(jié)構(gòu)[又分為三聚體、六聚體和高等分子量體構(gòu)型（HMW）]以及球型結(jié)構(gòu)域（global adiponectin,gAd），卻未發(fā)現(xiàn)過單體，它能夠與其特異性的受體AdipoR1、AdipoR

2、2和T-cadherin結(jié)合，發(fā)揮抗粥樣硬化、抗凋亡、抗炎、保護血管內(nèi)皮細胞、抑制血管平滑肌細胞增殖和遷移等積極的保護作用。
　　關(guān)于脂聯(lián)素在COPD中的生物學作用目前仍存有爭議。動物研究顯示脂聯(lián)素具有保護性作用，低脂聯(lián)素血癥會促進COPD的進展，并且脂聯(lián)素敲除小鼠形成的COPD容易并發(fā)肥胖及心血管疾病。而臨床研究發(fā)現(xiàn)COPD患者脂聯(lián)素水平增高，以高等分子量體（HMW）脂聯(lián)素水平增高為主，并且與肺功能的損害程度及TNF-α水平呈正

3、相關(guān)。那么，是否不同構(gòu)型的脂聯(lián)素在COPD疾病進展中發(fā)揮不同的作用或者COPD患者可能存在脂聯(lián)素受體的表達水平下調(diào)及其生物學功能的變化，從而影響脂聯(lián)素保護性作用的發(fā)揮，還需要進一步的科學研究來證實。
　　有研究提示脂聯(lián)素受體2（AdipoR2）的表達受miR-150的調(diào)控，從而影響脂聯(lián)素生物學作用的發(fā)揮。miR-150對AdipoR2表達的影響在COPD疾病發(fā)生發(fā)展中的作用還需要進一步的科學研究來證實。
　　基于以上研究現(xiàn)狀

4、與背景，本研究將通過觀察：
　?。?）不同構(gòu)型脂聯(lián)素對煙草煙霧提取物誘導的人支氣管上皮細胞凋亡及損傷的影響；
　　（2）HMW脂聯(lián)素及其受體在COPD患者肺組織及血清中表達水平的變化；
　　（3）miR-150在COPD患者肺組織中的表達水平及其與脂聯(lián)素受體2相關(guān)性，探討脂聯(lián)素及其受體在COPD疾病進展中的作用，為COPD及其合并癥的預防和早期診斷提供新的思路。
　　目的：
　　1.研究高等分子量體(HMW

5、)脂聯(lián)素和球形結(jié)構(gòu)域(gAd)脂聯(lián)素對煙草煙霧提取物誘導的人支氣管上皮細胞（16HBECs）凋亡水平、炎癥因子及氧化物質(zhì)表達的影響。
　　2.研究COPD患者肺組織及血清中HMW脂聯(lián)素及其受體的表達水平變化。
　　3.研究miR-150在COPD患者肺組織中的表達水平變化及其與脂聯(lián)素受體2的相關(guān)性。
　　方法：
　　1.16HBECs常規(guī)培養(yǎng)后接種于6孔培養(yǎng)板中，隨機分為對照組、5％CSE組、HMW脂聯(lián)素干預組和

6、gAd脂聯(lián)素干預組。對照組加入培養(yǎng)液；5%CSE組加入5%濃度CSE孵育24h；HMW、gAd干預組分別先以不同濃度的HMW脂聯(lián)素或gAd脂聯(lián)素預處理細胞2h，再加入5％CSE培養(yǎng)24h，收集各組別的細胞培養(yǎng)上清液，酶聯(lián)免疫吸附法檢測細胞培養(yǎng)上清液中IL-6、4-HNE水平，用流式細胞儀進行檢測細胞凋亡水平及細胞內(nèi)ROS水平。
　　2.選取2013年~2015年山西大醫(yī)院胸外科因肺部病變行肺葉切除術(shù)且術(shù)后病理學診斷明確的41例患者

7、，男26例，女15例，年齡(61±9)歲。分為肺功能正常組23例，其中病理結(jié)果為良性病變患者13例，病理結(jié)果為非小細胞肺癌患者10例；COPD組18例，其中病理診斷良性病變者10例，為單純COPD組，病理診斷非小細胞肺癌患者8例，為COPD合并肺癌組。COPD組患者嚴格按照COPD診斷標準明確診斷，均為穩(wěn)定期患者。手術(shù)前2周內(nèi)均無全身或呼吸道感染癥狀，血白細胞計數(shù)、血沉及肝腎功能等均正常。
　　排除標準：
　　(1)合并肺結(jié)

8、核、肺炎、間質(zhì)性肺疾病、支氣管哮喘及支氣管擴張等其他肺部疾病，有高血壓、糖尿病、冠心病等其他系統(tǒng)疾病及感染性疾病。
　　(2)各種原因所致的阻塞性肺炎。
　　(3)慢阻肺患者處于急性加重期。
　　(4)術(shù)前已放療或化療。
　　(5)不愿意配合和完全不能交流的患者。
　　此項研究已經(jīng)過學校倫理委員會審核通過。所有研究對象均已簽字同意。
　　3.手術(shù)方案由胸外科醫(yī)生制定并實施，術(shù)前記錄患者呼吸系統(tǒng)癥狀、藥

9、物治療史、吸煙史(吸煙指數(shù)＝每日吸煙支數(shù)×吸煙年數(shù))、CAT評分等臨床資料，記錄術(shù)前1周肺功能、血氣分析等檢查結(jié)果。術(shù)前經(jīng)過整晚禁食后，于早晨采取外周靜脈血10ml，分離血清儲存于-80℃冰箱中備用。術(shù)中遠離肺部病灶>5 cm取肺組織，肉眼觀察無肺癌浸潤的外周新鮮肺組織(2.5 cm×2.0 cm×2.0 cm)，PBS液沖洗血跡后儲存于-80℃冰箱中備用。
　　4.采用 ELISA法檢測肺組織勻漿和血清中 HMW脂聯(lián)素、T-鈣黏

10、蛋白（T-cadherin）、IL-6、IL-10、TNF-α、CRP、4-HNE和SP-D的表達水平。
　　5.采用Western blot法檢測肺組織脂聯(lián)素受體1(AdipoR1）、脂聯(lián)素受體2（AdipoR2）和T-鈣黏蛋白（T-cadherin）的蛋白表達水平。
　　6.生物信息學預測miR-150的靶基因。
　　7.采用熒光定量PCR法檢測肺組織miR-150的表達水平。
　　結(jié)果：
　　1.3個

11、不同濃度HMW脂聯(lián)素干預組IL-6、4-HNE蛋白含量、細胞內(nèi)ROS水平及細胞早凋率均低于5％CSE組，差異均有統(tǒng)計學意義（P均<0.01）。
　　2.3個不同濃度gAd脂聯(lián)素干預組IL-6、4-HNE蛋白含量、細胞內(nèi)ROS水平及細胞早凋率也均低于5％CSE組，差異均有統(tǒng)計學意義（P均<0.01）。
　　3.HMW脂聯(lián)素和gAd脂聯(lián)素與IL-6、4-HNE蛋白含量、細胞內(nèi)ROS水平及細胞早凋率呈負相關(guān)（P均<0.01）。

12、r>　　4.COPD組HMW脂聯(lián)素和細胞因子的表達水平
　　與肺功能正常組相比，COPD組肺組織和血清中HMW脂聯(lián)素表達水平均增高，差異均有統(tǒng)計學意義（P均<0.05）。
　　與肺功能正常組相比，COPD組肺組織和血清中IL-6、IL-10、CRP、4-HNE、TNF-α和SP-D均表達增高，差異均有統(tǒng)計學意義（P均<0.05）。
　　5.COPD組脂聯(lián)素受體的表達水平
　　與肺功能正常組相比，COPD組肺組織中

13、AdipoR1表達明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；AdipoR2表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　與肺功能正常組相比，COPD組肺組織和血清中T-cadherin表達未見明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。
　　6. COPD組HMW脂聯(lián)素與細胞因子及脂聯(lián)素受體2之間的相關(guān)性分析
　　COPD組血清中HMW脂聯(lián)素的表達與IL-6、IL-10、CRP、TNF-α、4-HNE和SP-

14、D均呈正相關(guān)（P均<0.05）。
　　COPD組肺組織HMW脂聯(lián)素與脂聯(lián)素受體2的表達水平呈負相關(guān)（P<0.05）。
　　7.COPD組血清中HMW脂聯(lián)素與患者臨床指標之間的相關(guān)性分析
　　COPD組血清中HMW脂聯(lián)素與肺功能FEV1占預計值的百分比、動脈血氧分壓呈負相關(guān)，與CAT評分呈正相關(guān)（P均<0.05）。
　　8.COPD合并肺癌組HMW脂聯(lián)素、細胞因子和脂聯(lián)素受體的表達
　　在COPD組內(nèi)，與單純

15、COPD組相比，COPD合并肺癌組肺組織和血清中HMW脂聯(lián)素和IL-6、IL-10、CRP、TNF-α、4-HNE和SP-D的表達均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P均<0.01）。
　　在COPD組內(nèi)，與單純COPD組相比，COPD合并肺癌組肺組織中脂聯(lián)素受體1和T-cadherin的表達均明顯升高，脂聯(lián)素受體2表達明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　9.生物信息學預測結(jié)果
　　利用多個生物信息學靶基因

16、預測網(wǎng)站分析并預測，發(fā)現(xiàn) miR-150種子序列與AdipoR2的3’UTR序列452-459堿基可完全配對，存在結(jié)合位點，并且預測分值>90。
　　10.兩組肺組織miR-150表達水平
　　雙因素方差分析提示肺癌、COPD兩因素對miR-150的表達存在明顯的交互作用(F=59.61，P<0.01)。進一步行簡單效應分析發(fā)現(xiàn)，與肺功能正常的非肺癌患者相比，單純COPD患者 miR-150表達未見明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義

17、（P>0.05）；與肺功能正常的非小細胞肺癌患者相比，COPD合并非小細胞肺癌患者miR-150表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　11.COPD組肺組織miR-150表達水平及其與AdipoR2表達之間的相關(guān)性
　　在COPD組內(nèi)，與單純COPD組相比，COPD合并肺癌組肺組織miR-150表達水平明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　在COPD組內(nèi)，單純COPD組肺組織miR-150與

18、AdipoR2的表達水平無相關(guān)性（P>0.05）；COPD合并肺癌組中，肺組織miR-150與AdipoR2的表達水平呈明顯負相關(guān)（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.HMW脂聯(lián)素及gAd脂聯(lián)素可以降低煙草煙霧提取物對人支氣管上皮細胞的凋亡及損傷作用，其可能成為COPD新的治療靶點。
　　2.HMW脂聯(lián)素和多種細胞因子共同參與了COPD的病理生理過程，并且與患者的肺功能、低氧血癥和臨床癥狀評分密切相關(guān)。
　　3

19、.作為HMW脂聯(lián)素的受體，AdipoR2的表達下調(diào)影響了其保護性的抗炎作用，從而可能促進了在COPD的疾病進展
　　4.作為HMW脂聯(lián)素特異性的受體，T-cadherin可能并未參與COPD的炎癥反應和氧化應激機制中。T-cadherin的表達上調(diào)可能參與了COPD合并非小細胞肺癌的病理生理過程。
　　5.脂聯(lián)素受體表達的變化可能成為COPD合并非小細胞肺癌的生物學預測指標。
　　6.miR-150在COPD患者中表達