線粒體凋亡通路相關(guān)基因在輻射旁效應(yīng)中的表達(dá)變化及歸芪益元膏干預(yù)研究.pdf

1、目的：探討線粒體凋亡通路中相關(guān)基因在輻射旁效應(yīng)中的表達(dá)變化及歸芪益元膏對(duì)X射線和重離子輻射旁效應(yīng)中線粒體凋亡通路中Cytc、Caspase-9、Caspase-3、Bax、Bcl-2基因表達(dá)的影響。
　　方法：本研究分兩部分，
　　第一部分探討線粒體凋亡通路中相關(guān)基因在不同劑量X射線誘發(fā)體內(nèi)旁效應(yīng)中的表達(dá)變化及歸芪益元膏干預(yù)作用。70只雄性 Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組和2Gy輻射6h組、2Gy輻射24h組、2Gy輻射

2、48h組、4Gy輻射6h組、4Gy輻射24h組、4Gy輻射48h組、8Gy輻射6h組、8Gy輻射24h組、8Gy輻射48h組。除正常對(duì)照組外，其余各組大鼠分別予2、4、8GyX射線單次照射右肺部，鉛皮屏蔽身體其余部位。分別于照射后6h、24h、48h處死輻射各組大鼠7只，Q-PCR檢測(cè)大鼠右肺、左肺、左腎組織中Cytc、Caspase-9、Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)變化。
　　后將36只Wistar雄性大

3、鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組，輻射組和中藥組。在照射前，中藥組灌胃歸芪益元膏2周（3.28g·kg-1·d-1），正常對(duì)照組和輻射組灌胃等量生理鹽水。2周后，輻射組和中藥組大鼠右肺予8GyX射線單次照射，正常對(duì)照組不予照射，照射后24h處死各組大鼠，Q-PCR、免疫組化和Western Blot檢測(cè)大鼠右肺、左肺、左腎組織中Cytc、Caspase-9、Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)，HE染色觀察大鼠肺腎組織病理形態(tài)

4、學(xué)變化，全自動(dòng)動(dòng)物血球分析儀檢測(cè)各組大鼠外周血白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)、血小板(PLT)計(jì)數(shù)。
　　第二部分研究歸芪益元膏對(duì)重離子輻射誘發(fā)體內(nèi)旁效應(yīng)中線粒體凋亡通路相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控作用。42只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組和輻射6h組、輻射12h組、輻射24h組、中藥6h組、中藥12h組、中藥24h組。照射前，中藥各組灌胃歸芪益元膏2周（3.28g·kg-1·d-1），正常對(duì)照組和輻射各組灌

5、胃等量生理鹽水。2周后，輻射各組和中藥各組大鼠右肺予2Gy12C6+離子束單次照射，正常對(duì)照組不予照射。照射后6、12、24h處死各組大鼠6只，HE染色觀察右肺、左肺、左腎病理變化，檢測(cè)各組大鼠的外周血WBC、RBC、HGB、PLT計(jì)數(shù)，ELISA法檢測(cè)大鼠血清中IL-6、IL-1β、TGF-β1、IL-8、TNF-α含量變化，Q-PCR、免疫組化和Western Blot檢測(cè)右肺、左肺、左腎組織中Cytc、Caspase-9、Casp

6、ase-3、Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　第一部分：2Gy、4Gy、8Gy輻射各組大鼠右肺、左肺、左腎中Cytc、Caspase-9、Caspase-3 mRNA表達(dá)量在照射后均明顯升高。右肺中，除8Gy輻射48h組之外，其余輻射各組Bax mRNA表達(dá)量均明顯升高。左肺中，輻射各組Bax mRNA表達(dá)量均明顯升高。左腎中，除2Gy輻射6h組之外，其余輻射組Bax mRNA表達(dá)量均明顯升高，與正常

7、對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。右肺、左肺中，輻射各組Bcl-2 mRNA表達(dá)量均降低，左腎中，除8Gy6h組之外，其余輻射組Bcl-2 mRNA表達(dá)量均降低，與正常對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　8GyX射線單次照射大鼠右肺后24h，大鼠右肺肺泡壁增厚，肺泡腔內(nèi)有滲出物及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，左肺肺泡腔內(nèi)有少量滲出物及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，左腎未見(jiàn)明顯病理?yè)p傷；外周血WBC、RBC、HGB、PLT計(jì)數(shù)明顯降

8、低，右肺、左肺、左腎組織中Cytc、Caspase-9、Caspase-3、Bax蛋白及mRNA表達(dá)量明顯升高，Bcl-2蛋白及mRNA表達(dá)量明顯下降，與正常對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。中藥組肺部病理?yè)p害明顯減輕，外周血WBC、RBC、HGB、PLT計(jì)數(shù)明顯升高，右肺、左肺、左腎組織中Cytc、Caspase-9、Caspase-3、Bax蛋白及mRNA表達(dá)量明顯下降，Bcl-2蛋白及mRNA表達(dá)量明顯升高，與輻射組

9、相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　第二部分：2Gy12C6+離子照射大鼠右肺部后，與正常對(duì)照組相比，輻射12h組外周血WBC、RBC、HGB、PLT計(jì)數(shù)明顯下降（P＜0.01），血清中TGF-β1、IL-6、IL-1β、IL-8含量明顯升高（P＜0.01）；輻射6h組TNF-α含量明顯升高（P＜0.01）。HE染色顯示照射后6h右肺開(kāi)始出現(xiàn)了少量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及肺泡壁毛細(xì)血管出血，隨著時(shí)間的推移，病理?yè)p傷逐漸加重，肺

10、泡壁增厚、肺泡腔內(nèi)有滲出物及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁毛細(xì)血管充血、出血；左肺在6h和12h未見(jiàn)明顯病理改變，24h時(shí)肺泡腔內(nèi)有少量滲出物及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。左腎在輻射后6h、12h、24h無(wú)明顯病理變化。右肺、左肺、左腎組織中Cytc、Caspase-9、Caspase-3、Bax mRNA表達(dá)量在照射后6h、12h、24h均明顯升高，而Cytc、Caspase-9、Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)量只在照射后24h明顯升高，與正常對(duì)照組相比

11、，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；右肺中Bcl-2蛋白及mRNA表達(dá)量在照射后24h明顯降低，左肺、左腎組織中 Bcl-2蛋白及 mRNA表達(dá)量在照射后6h、12h、24h均明顯降低，與正常對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　中藥各組雙肺組織病理?yè)p傷較輻射各組明顯減輕。中藥12h組外周血WBC、RBC、HGB、PLT計(jì)數(shù)明顯高于輻射12h組，血清中TGF-β1、IL-6、IL-1β、IL-8含量明顯低于輻射1

12、2h組，中藥6h組TNF-α含量明顯低于輻射6h組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。右肺、左肺、左腎中，中藥24h組Cytc、Caspase-9、Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)量明顯低于輻射24h組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。右肺中，中藥6h、24h組Cytc、Caspase-9、Bax mRNA表達(dá)量明顯低于同時(shí)間點(diǎn)的輻射組，中藥12h組、24h組Caspase-3 mRNA表達(dá)量均明顯低于同時(shí)間點(diǎn)的輻射組，差異均有

13、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；左肺中，中藥6h、12h、24h組Cytc mRNA表達(dá)量均明顯低于同時(shí)間點(diǎn)的輻射組，中藥12h、24h組Caspase-9、Bax mRNA表達(dá)量明顯低于同時(shí)間點(diǎn)的輻射組，中藥24h組Caspase-3 mRNA表達(dá)量明顯低于輻射24h組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；左腎中，中藥6h、12h、24h組Caspase-9 mRNA表達(dá)量均明顯低于同時(shí)間點(diǎn)的輻射組，中藥12h、24h組Cytc、Casp

14、ase-3 mRNA表達(dá)量均明顯低于同時(shí)間點(diǎn)的輻射組，中藥24h組Bax mRNA表達(dá)量明顯低于輻射24h組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。右肺中，中藥24h組Bcl-2蛋白及mRNA表達(dá)量高于輻射24h組，左肺、左腎中，中藥6h、12h、24h組Bcl-2蛋白及mRNA表達(dá)量均明顯高于同時(shí)間點(diǎn)的輻射組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　1、不同劑量X射線和重離子照射大鼠右肺部后，右肺組織中Cytc

15、、Caspase-9、Caspase-3、Bax、Bcl-2基因表達(dá)變化明顯，其中Cytc、Caspase-9、Caspase-3、Bax表達(dá)均顯著上調(diào)，Bcl-2明顯下調(diào)。左肺和左腎中也呈現(xiàn)出相似的基因表達(dá)變化，表明未直接受照射組織也對(duì)X射線和重離子輻射產(chǎn)生了響應(yīng)，輻射誘導(dǎo)了體內(nèi)旁效應(yīng)的產(chǎn)生。各輻射劑量之間、各時(shí)間點(diǎn)之間尚未發(fā)現(xiàn)明顯的效應(yīng)差異。
　　2、歸芪益元膏通過(guò)延緩Bcl-2表達(dá)的下調(diào)，而抑制Cytc、Bax表達(dá)的上調(diào)，進(jìn)