輻射致AHH-1旁效應(yīng)差異表達(dá)基因信息學(xué)分析及部分基因研究.pdf

1、研究內(nèi)容: 1．基因芯片檢測出不同劑量60Coγ射線照射人淋巴母細(xì)胞(AHH-1)及與其共同培養(yǎng)未照射細(xì)胞差異表達(dá)基因譜。利用生物信息學(xué)方法分析篩選輻射旁效應(yīng)相關(guān)差異表達(dá)基因。 2．對候選輻射相關(guān)和旁效應(yīng)相關(guān)的基因進(jìn)行分子生物學(xué)驗證，得到的陽性結(jié)果進(jìn)一步分析功能和可能在輻射效應(yīng)或旁效應(yīng)中的作用，探尋可能的存在的機(jī)制。 研究方法: 1．芯片數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析方法主要是使用生物信息學(xué)軟件、在線軟件和網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)

2、庫對數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析、功能分析、序列比對和進(jìn)化樹的構(gòu)建。 2．重復(fù)芯片樣品準(zhǔn)備，生物學(xué)驗證主要使用PCR的方法檢測樣品中各基因RNA的表達(dá)量。 3．照射細(xì)胞和旁效應(yīng)細(xì)胞長期培養(yǎng)、加入磷酸化抑制劑，檢測蛋白活性的變化。 4．統(tǒng)計學(xué)方法：單樣本t檢驗、單因素方差分析 結(jié)果: 1．γ射線直接照射細(xì)胞及其旁效應(yīng)細(xì)胞基因表達(dá)譜： 與正常對照組比較：2.0Gy旁效應(yīng)細(xì)胞(P2.0)中有上調(diào)基因107個

3、，下調(diào)基因6個；0.5Gy旁效應(yīng)細(xì)胞(P0.5)中有上調(diào)基因57個，下調(diào)基因8個；2.0Gy直接照射細(xì)胞(Z2.0)中有上調(diào)基因90個，下調(diào)基因349個；0.5Gy直接照射細(xì)胞(Z0.5)中有上調(diào)基因67個，下調(diào)基因29個．其中17個基因表達(dá)隨劑量增大而增大，6個基因低劑量下調(diào)而高劑量和共培養(yǎng)細(xì)胞上調(diào)：分析僅在Z0.5變化的基因在P0.5中變化明顯，提示旁效應(yīng)的產(chǎn)生與照射劑量有關(guān)。 2．聚類分析結(jié)果： 篩選的差異表達(dá)基因

4、在GO功能分類中細(xì)胞膜蛋白、細(xì)胞聯(lián)接、周期相關(guān)和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白占了絕大部分，同時它們參與了轉(zhuǎn)錄、翻譯、細(xì)胞周期、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞凋亡、氧化還原、氧化磷酸化等功能模塊。研究者認(rèn)為細(xì)胞受到低劑量照射的刺激后并非直接死亡，卻間接刺激了膜分泌和細(xì)胞間通訊。 3．Z0.5和P0.5均明顯變化的基因： BAX，ZNF652，GINS4，F(xiàn)OS，AP1S1，PTPRJ(CD148，PTP受體家族的一種酩氨酸磷酸酶)在Z0.5和P0.5表

5、達(dá)均明顯變化。表明這些基因與低劑量照射生物學(xué)效應(yīng)發(fā)生有關(guān)。進(jìn)化樹中可以看出GINS4(目前GINS4還無G0分類)和ZNF652(鋅指蛋白652)距離較近，AP1S1(AP-1家族網(wǎng)格蛋白(Clathrin)的一種)和他們也相近，AP1S1、GINS4和ZNF652在結(jié)構(gòu)和功能上可能有某種聯(lián)系，且四個均與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞分泌有關(guān)，只有BAX(Bcl-2相關(guān)蛋白x)的五種蛋白和他們距離較遠(yuǎn)說明他們發(fā)生相互作用的可能性很小， 4．

6、與照射劑量關(guān)系不大的蛋白序列比對結(jié)果： 一些基因在0.5Gy照射和2Gy照射均發(fā)生變化，我們將這些基因所表達(dá)的蛋白進(jìn)行多序列比，果均顯示PAPLN(原腸(胚)形成糖蛋白)與假定蛋白LOC375010距離較近，并且與BAX的5種蛋白較遠(yuǎn)，提示PAPLN和LOC375010在結(jié)構(gòu)和功能上可能有某種內(nèi)在聯(lián)系。 5．多種鋅指蛋白在直接照射細(xì)胞和旁效應(yīng)細(xì)胞表達(dá)變化：在芯片結(jié)果中我們發(fā)現(xiàn)多種鋅指蛋白在直接照射細(xì)胞和旁效應(yīng)細(xì)胞表達(dá)變化

7、．發(fā)現(xiàn)ZNF423同家族的成員參與了生長因子TGF-β的信號通路，同時在芯片數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)鋅指蛋白家族ZC3H7A參與了TGF-β1信號通路；受到2Gy照射后上調(diào)2.2倍，編碼TGF-β1的基因在受到2Gy照射后也上調(diào)1.8倍。 6．對功能未知差異表達(dá)基因的生物信息學(xué)分析結(jié)果： 對一些還無分類，功能未知的差異表達(dá)基因在NCBI上BLAST未發(fā)現(xiàn)相似度較高的信息。發(fā)現(xiàn)候選癌基因CACS4與假定蛋白LOC375010距離較近，可

8、能在功能上有某種聯(lián)系． 7．可能與輻射誘導(dǎo)的旁效應(yīng)關(guān)系密切的基因功能分析 根據(jù)芯片數(shù)據(jù)聚類結(jié)果和基因信息查詢結(jié)果，發(fā)現(xiàn)一些細(xì)胞通路中重要的基因，通過網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)很多差異表達(dá)基因在TP53相關(guān)細(xì)胞周期通路、BAX相關(guān)凋亡通路和TGF-β信號通路中。 8．通過對芯片分析篩選基因中15個目前還未報道與輻射或旁效應(yīng)相關(guān)的候選基因驗證實驗發(fā)現(xiàn)，表達(dá)均有顯著改變。 8.1跨膜相關(guān)的差異表達(dá)基因：PTPRJ、PAPL

9、N和VDAC3(電壓門控通道3)；PTPRJ在低劑量直接照射和旁效應(yīng)細(xì)胞中表達(dá)明顯下調(diào)(P＜0.05)，RT-PCR也驗證了它的下調(diào)，在2.0Gy直接照射細(xì)胞中也有明顯下調(diào)(P＜0.05)。PAPLN照射以后上調(diào)而旁效應(yīng)無明顯變化，驗證實驗確發(fā)現(xiàn)照射后明顯下調(diào)。VDAC3旁效應(yīng)細(xì)胞中RNA表達(dá)變化與芯片數(shù)據(jù)一致，其對于低劑量和高劑量輻射反映呈相反趨勢，在低劑量直接照射和旁效應(yīng)細(xì)胞中表達(dá)明顯下調(diào)，在高劑量直接照射和旁效應(yīng)細(xì)胞中表達(dá)明顯上調(diào)

10、。 8.2胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因：AP1S1，PDP2(丙酮酸脫氫磷酸酶2)；AP1S1 RNA表達(dá)在直接照射組細(xì)胞變化不顯著，而在旁效應(yīng)細(xì)胞中表達(dá)顯著增高(P＜0.05)，并隨著劑量增加而增加，與芯片結(jié)果一致。PDP2在Z0.5和P0.5上調(diào)，Z2.0下調(diào)明顯，與芯片一致；而在P2.0細(xì)胞中卻沒有顯著變化 8.3核內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，與細(xì)胞周期凋亡相關(guān)的差異表達(dá)基因：ZNF652、FOS、TPR、ZMAT3(P53相關(guān)鋅指蛋白

11、)、CFLAR；qPCR結(jié)果顯示ZNF652在Z0.5，P0.5中明顯上調(diào)(P＜0.05)，與芯片一致，Z2.0也有明顯上調(diào)(P＜0.05)。FOS在Z2.0細(xì)胞中RNA與芯片數(shù)據(jù)一致，無明顯表達(dá)變化，Z0.5，P0.5，P2.0變化沒有芯片顯著，但是也都明顯下調(diào)(P＜0.05)。TPR照射細(xì)胞中RNA表達(dá)變化與芯片數(shù)據(jù)一致，在Z0.5細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)。ZMAT3在Z0.5，P0.5，P2.0細(xì)胞中RNA表達(dá)變化與芯片數(shù)據(jù)

12、一致，在0.5Gy和2Gy照射均有上調(diào)(P＜0.05)，并且0.5Gy上調(diào)較明顯；CFLAR在Z2.0，P0.5，P2.0細(xì)胞中RNA表達(dá)變化與芯片數(shù)據(jù)一致．在Z2.0細(xì)胞中明顯下調(diào)，而Z0.5和P0.5旁效應(yīng)細(xì)胞中卻明顯上調(diào)(P＜0.05)， 8.4差異表達(dá)的未知基因：LOC375010、C120rf5(染色體開放讀框，又名TIGAR)、GINS4(GIN蛋白復(fù)合體4)；LOC375010在Z2.0細(xì)胞中RNA表達(dá)明顯上調(diào)(P

13、＜0.05)，在旁效應(yīng)中變化比芯片顯著，有上調(diào)趨勢。C12orf5在其他發(fā)表的輻射相關(guān)芯片數(shù)據(jù)中也發(fā)現(xiàn)有下調(diào)，我們芯片數(shù)據(jù)中在Z2.0有明顯下調(diào)，RT-PCR驗證發(fā)現(xiàn)Z2.0確實有明顯下調(diào)(P＜0.05)，而Z0.5和P0.5卻上調(diào)明顯，P2.0下調(diào)。 9．Caspase8(半胱氨酸蛋白水解酶8)檢測 照射和旁效應(yīng)細(xì)胞中Caspase8活性有降低的現(xiàn)象，多次相同劑量照射均有明顯降低(P＜0.05)，但是加入磷酸化抑制劑后

14、這種變化消失(各樣本中)，Caspase8酶活性均降為同一水平。細(xì)胞培養(yǎng)30天后發(fā)現(xiàn)照射細(xì)胞Caspase8酶活性增加(P＜0.05)，而旁效應(yīng)細(xì)胞中卻無明顯改變。 結(jié)論: 1．γ射線直接照射細(xì)胞可導(dǎo)致與其共同培養(yǎng)的旁效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生眾多差異表達(dá)基因。發(fā)現(xiàn)一些基因在各劑量組照射細(xì)胞中均發(fā)生變化，提示這些基因的變化可能在一定劑量范圍內(nèi)與照射劑量關(guān)系不大；一些基因的變化在一定劑量范圍內(nèi)直接和間接照射效應(yīng)相似，提示旁效應(yīng)的產(chǎn)生與可

15、能照射劑量有關(guān)。 2．從聚類結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因中細(xì)胞連接通訊占很大部分；旁效應(yīng)研究者認(rèn)為細(xì)胞受到低劑量照射的刺激后并非直接死亡，卻間接刺激了膜分泌和細(xì)胞間通訊。這些數(shù)據(jù)結(jié)果和輻射誘導(dǎo)旁效應(yīng)的觀點相吻合。一些細(xì)胞通路中出現(xiàn)的重要的差異表達(dá)基因，很可能參與到輻射旁效應(yīng)機(jī)制中。部分磷酸酶受體分子的下調(diào)可能與低劑量輻射反應(yīng)信號因子傳遞有關(guān)。 3．多序列比對發(fā)現(xiàn)一些可能有相互作用的差異表達(dá)基因，它們的核酸或蛋白序列距離較近。

16、對未知基因的分析與驗證，可能有助于新功能的發(fā)現(xiàn)和低劑量輻射機(jī)制的深入研究。 4．驗證結(jié)果大部分與芯片數(shù)據(jù)一致，表明這些基因在照射或旁效應(yīng)機(jī)制中可能起了重要作用。AP1S1，F(xiàn)OS(一個FBJ病毒癌基因，可抑制癌細(xì)胞的遷移)，TPR和膜通道蛋白VDAC3，PTPRJ在旁效應(yīng)細(xì)胞中改變與芯片一致，可能與低劑量輻射反應(yīng)信號因子傳遞有關(guān)，ZNF652照射和旁效應(yīng)中的反應(yīng)和腫瘤細(xì)胞相反，表達(dá)上調(diào)結(jié)合抑瘤基因的功能增強(qiáng)，ZMAT3也同樣上調(diào)

17、，他們可能在DNA損傷的修復(fù)過程中起作用，有進(jìn)一步深入研究的價值。 5．照射細(xì)胞和旁效應(yīng)細(xì)胞中Caspase8酶活性有降低的現(xiàn)象(P＜0.05)，加入磷酸化抑制劑以后這種變化消失，Caspase8酶活性均降為同一水平?？赡芤驗榈蛣┝康碾婋x輻射及其誘導(dǎo)的旁效應(yīng)可以誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白的上調(diào)(BAX，CFLAR，ZMAT3，TIGAR等)，這些蛋白作用于被激活的Caspase8或P53通路，使得Caspase8活性下降。而加入磷酸化抑制