阿米福汀通過抑制凋亡和減少氧化應(yīng)激保護(hù)心肌缺血再灌注損傷.pdf

1、目的：
　　研究阿米福汀對叔丁基過氧化氫培養(yǎng)的H9c2細(xì)胞和C57BL/6小鼠缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及探討其相關(guān)機(jī)制。
　　方法：
　　體外實驗，用叔丁基過氧化氫（TBHP）刺激心肌細(xì)胞，不同濃度阿米福汀預(yù)處理細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞生存分析，流式分析實驗。體內(nèi)實驗，雄性6-7周C57BL/6小鼠分成4組：假手術(shù)組：尾靜脈注射0.2ml0.9％生理鹽水（NS），30min后異氟醚麻醉小鼠，7-0的縫合絲線在左冠狀動脈前降支(L

2、AD)下通過，不結(jié)扎;I/R對照組：小鼠用0.2ml0.9%生理鹽水（NS）尾靜脈注射，30min后異氟醚麻醉小鼠，7-0的縫合絲線在左冠狀動脈前降支(LAD)下通過并結(jié)扎，30min后松開結(jié)扎線，再灌注4小時后取血、取心臟;I/R+L組：小鼠用阿米福汀溶液0.2ml（80mg/kg，溶于0.9%生理鹽水）尾靜脈注射預(yù)處理30min，異氟醚麻醉小鼠，LAD結(jié)扎30min，再灌注4小時，取血、取心臟，方法同I/R組;I/R+H組：小鼠用阿

3、米福汀溶液0.2ml（400mg/kg，溶于0.9%生理鹽水）尾靜脈注射，30min后麻醉，LAD結(jié)扎30min，再灌注4小時，取血、取心臟，方法同I/R組。采用Evans blue/TTC雙染法檢測各組心肌梗死面積的大小，TUNEL染色法檢測心肌切片心肌細(xì)胞的凋亡情況，DHE染色檢測心肌切片ROS表達(dá)情況，western blot法檢測SOD1、SOD2、Bax、Bcl2、Cleaved-Caspase3的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：

4、
　　⑴阿米福汀預(yù)處理H9c2細(xì)胞能顯著減弱TBHP刺激引起的細(xì)胞凋亡和死亡。用100μM和200μM的TBHP刺激H9c2細(xì)胞12小時能夠使細(xì)胞存活率顯著降低，分別為對照組（0.55±0.03）和（0.50±0.02）；使用100μM的阿米福汀預(yù)處理30min則明顯增加H9c2細(xì)胞的生存率，為對照組的（0.97±0.05）。⑵流式細(xì)胞儀檢測分析，用200μM TBHP刺激H9c2細(xì)胞能顯著增加ROS的水平（48.61±2.25）

5、，而阿米福汀能夠有效的抑制ROS的生成，5μM（33.61±1.72）、10μM（28.78±1.72）、20μM（20.47±1.94），P＜0.05；與 TBHP組（53.80±2.29）比較，高劑量阿米福汀組（6.53±1.10）能夠顯著抑制H9c2細(xì)胞的凋亡，P＜0.05。⑶Evans Blue/TTC雙染顯示，與I/R對照組（46.97±3.11）相比，高劑量阿米福汀組（21.25±2.47）能夠顯著減少心肌梗死面積，P＜0.

6、05。⑶心肌切片染色檢測分析，與 I/R組（32.42±2.80）比較，高劑量阿米福汀組（6.03±2.16）顯著減少了TUNEL陽性細(xì)胞染色；同樣，在DHE染色中，高劑量阿米福汀組（6.40±1.88）與I/R組（44.05±3.43）比較，DHE染色陽性細(xì)胞顯著減少，P＜0.05。⑸用MDA試劑盒檢測分析心肌組織蛋白中的含量，結(jié)果顯示，假手術(shù)組（1.51±0.12），I/R組（4.22±0.39），高劑量阿米福汀組（1.80±0.2

7、4），與假手術(shù)組比較，I/R組MDA水平顯著增加，高劑量阿米福汀組能夠顯著抑制MDA水平的增加，P＜0.05；用SOD試劑盒檢測心肌組織蛋白中含量，結(jié)果顯示，假手術(shù)組（200.00±10.77），I/R組（120.33±11.00），高劑量阿米福汀組（181.83±10.44），與假手術(shù)組比較，I/R組 SOD水平顯著降低，高劑量阿米福汀組能夠顯著增加SOD水平的增加，P＜0.05。⑹蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測，高劑量阿米福汀組SOD1表達(dá)

8、（0.37±0.04），SOD2表達(dá)（0.37±0.04），Bcl2表達(dá)（0.58±0.04），與I/R組SOD1表達(dá)（0.25±0.03）， SOD2表達(dá)（0.15±0.03），Bcl2表達(dá)（0.44±0.03）比較明顯增加，P＜0.05；而高劑量阿米福汀組Cleaved Caspase3表達(dá)（0.45±0.02）和Bax表達(dá)（0.43±0.02），與I/R組比較Cleaved Caspase3表達(dá)（0.66±0.04），Bax表達(dá)（