柚皮苷通過抑制miR-223表達(dá)減輕中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的大鼠脊髓損傷的實(shí)驗研究.pdf

1、目的:通過建立大鼠急性脊髓損傷模型，利用肢體神經(jīng)功能評分、組織病理學(xué)改變及分子生物學(xué)技術(shù)研究柚皮苷對急性脊髓損傷后大鼠的影響，探究柚皮苷的神經(jīng)保護(hù)作用及神經(jīng)炎癥機(jī)制。以期對脊髓損傷的治療提供新思路，并為后續(xù)實(shí)驗研究奠定一定的基礎(chǔ)。
　　方法:本實(shí)驗分為三部分。第一部分:柚皮苷改善大鼠急性脊髓損傷后神經(jīng)功能的實(shí)驗研究。分以下三步:1、成年SD大鼠隨機(jī)分為五組(n=15)，A.對照組;B.假手術(shù)組;C.脊髓損傷+生理鹽水組(SCI組)

2、;D.脊髓損傷+柚皮苷50mg組（50mg/kg.p.o）E.脊髓損傷+柚皮苷100mg組（100mg/kg.p.o），按標(biāo)準(zhǔn)建立脊髓損傷大鼠模型，藥物組術(shù)前3天、術(shù)后7天共11天連續(xù)應(yīng)用柚皮苷，A組大鼠僅行椎板切除術(shù)，不損傷脊髓，設(shè)為陰性對照。B組大鼠行椎板切除術(shù)后用生理鹽水行髓內(nèi)注射，設(shè)為陽性對照。C、D、E組大鼠全部行T9-11椎板全切術(shù)并按標(biāo)準(zhǔn)步驟用脊髓打機(jī)器造成脊髓損傷模型。于術(shù)后12h、1d、3d、7d各時間點(diǎn)，應(yīng)用CBS、

3、BBB評分標(biāo)準(zhǔn)對各組實(shí)驗動物肢體運(yùn)動功能進(jìn)行評分，觀察柚皮苷對大鼠脊髓損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。第二部分:柚皮苷抑制大鼠急性脊髓損傷后炎癥反應(yīng)的實(shí)驗研究。分組及造模情況同第一部分。觀察術(shù)后7天即用藥11天后柚皮苷對炎癥反應(yīng)的抑制情況。分以下三步:1、HE染色光鏡下觀察大鼠損傷后脊髓形態(tài)學(xué)變化;2、RT-qPCR技術(shù)檢測術(shù)后7天IL-1β、IL-6、IL-8、HMGB1和TNF-α的miRNA的表達(dá);3、western-b1ot檢測術(shù)后7天1L

4、-1β，1L-6，1L-8，HMGB1及TNF-α表達(dá)。3、第三部分:柚皮苷通過抑制miR-223的表達(dá)減輕中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的大鼠脊髓損傷的實(shí)驗研究。分以下三步:1、RT-qPCR技術(shù)檢測術(shù)后12h、1d、3d、7d各時間點(diǎn)miR-223表達(dá);2、術(shù)后12h、1d、3d、7d各時間點(diǎn)脊髓組織MPO的活性檢測(可以通過MPO的活性來間接評估中性粒細(xì)胞對脊髓組織的浸潤程度）;3、原位雜交技術(shù)檢測術(shù)后12h、1d、3d、7d各時間點(diǎn)脊髓組織中m

5、iR-223的定位;4、脊髓損傷后12h、1d、3d、7d個時間點(diǎn)miR-223表達(dá)和中性粒細(xì)胞浸潤的相關(guān)性分析。
　　結(jié)果:第一部分:BBB評分顯示:造模后4小時C、D、E組評分顯著低于術(shù)前，A、B組術(shù)前術(shù)后無差別，說明造模成功。造模后12h、1d、3d、7d，BBB及CBS評分結(jié)果一致，均發(fā)現(xiàn)脊髓損傷組評分趨勢逐漸升高，術(shù)后7d評分最高。各時間點(diǎn)脊髓損傷組評分均明顯低于對照組和假手術(shù)組，組間比較差異顯著，均P＜0.01。柚皮苷

6、組各時間點(diǎn)評分均高于SCI組，E組評分更高。造模后12h、1d，柚皮苷兩組與SCI組組間比較差異不顯著，P＞0.05。造模后3d、7d，柚皮苷兩組與SCI組組間比較差異有顯著性，P＜0.01。第二部分:1.造模后7天，即柚皮苷連續(xù)應(yīng)用11天后，光鏡下?lián)p傷后脊髓組織病理改變?nèi)缦?對照組（A組）及假手術(shù)組（B組），光鏡下脊髓組織未見空洞、液化及炎性細(xì)胞浸潤。SCI+生理鹽水組（C組），光鏡下可見大量炎性細(xì)胞浸潤，空洞、液化形成，神經(jīng)元萎縮，

7、神經(jīng)纖維排列紊亂。脊髓損傷+柚皮苷50mg組（D組）和脊髓損傷+柚皮苷100mg組（E組）中也可見空洞形成，空洞數(shù)量比C組顯著減少，神經(jīng)細(xì)胞保留更多，脊髓染色圖片D、E差別不大，但E組空洞數(shù)量更少，神經(jīng)細(xì)胞保留更多。2.RT-qPCR技術(shù)評估了造模后7天1L-1β，1L-6，1L-8，HMGB1及TNF-α的miRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在脊髓損傷后，1L-1β、1L-6、1L-8、HMGB1、TNF-α的miRNA在脊髓損傷中心區(qū)域表達(dá)均明顯增

8、高，但這種高表達(dá)在應(yīng)用柚皮苷治療后得到抑制，柚皮苷組與SCI組組間比較，差異具有顯著性，P＜0.01。3.western-blot（免疫印跡）檢測到在脊髓損傷區(qū)這些炎性因子蛋白表達(dá)也明顯增高，應(yīng)用柚皮苷治療后，這種表達(dá)得到抑制，柚皮苷組與SCI組組間比較，差異有顯著性，P＜0.0，1。第三部分:1.RT-qPCR檢測術(shù)后各時間點(diǎn)miR-223的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在脊髓損傷后1d，miR-223在脊髓損傷中心區(qū)域表達(dá)明顯增高，造模后7天，SCI組

9、表達(dá)輕度降低，柚皮苷組表達(dá)顯著降低，與SCI組比較，差異有顯著性，P＜0.01。2.MPO活性檢測:脊髓損傷后24小時，MPO活性明顯升高，術(shù)后7d，即連續(xù)應(yīng)用柚皮苷治療11天后，對比C組，D、E組MPO活性顯著降低，說明SCI后中性粒細(xì)胞在損傷后24小時浸潤最嚴(yán)重，應(yīng)用柚皮苷后中性粒細(xì)胞浸潤得到有效抑制。3.原位雜交實(shí)驗表明miR-223的信號表達(dá)與中性粒細(xì)胞相融合而且位于中性粒細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，在損傷的中心區(qū)miR-223表達(dá)最強(qiáng)烈。