重水標記法測定大鼠日糧賴氨酸攝入量對血液白蛋白代謝動力學的影響.pdf

1、實驗目的:
　　本課題主要分為兩部分，第一部分以2H2O作為示蹤劑標記動物體內白蛋白，以期建立2H2O標記丙氨酸的檢測方法，為研究蛋白質分數合成率提供方法保證;第二部分為研究在日常飲食狀態(tài)下，大鼠在較長時間內攝入含有低(0.2％)、正常(0.9％)、高(1.6％)賴氨酸飼料，血液白蛋白的代謝動力學是否一致，白蛋白的分數合成率是否相同，分析血漿白蛋白代謝動力學指標是否對賴氨酸攝入量敏感，為進一步研究對賴氨酸攝入量較敏感的檢測指標建立

2、方法體系，從而為確定人體賴氨酸需要量的研究奠定基礎。
　　實驗方法:
　　第一部分
　　(1)重水短時間(90min)標記大鼠，分離血漿。
　　(2)采用三氯乙酸/乙醇法對大鼠血液白蛋白進行初步提純，并清除表面殘留游離氨基酸。
　　(3)經SDS-PAGE鑒定提純蛋白為白蛋白。
　　(4)酸水解法水解白蛋白，收集水解后丙氨酸，同時收集血液游離丙氨酸。
　　(5)對兩種來源丙氨酸進行分離和純化。<

3、br>　　(6)對丙氨酸進行衍生化處理，經GC/MS檢測，確定了重水標記丙氨酸檢測方法的可行性。
　　第二部分
　　(1)參考AIN-93G各成分比例設計大鼠純化飼料，三種飼料賴氨酸含量分別為低(0.2％)、正常(0.9％)、高(1.6％)。生產后隨即檢測飼料氨基酸組分。
　　(2)健康成年雄性SD大鼠72只，12周齡，體重320g左右，隨機分為3組，每組24只。分別給予低賴氨酸(0.2％)飼料、正常賴氨酸(0.9％)

4、飼料和高賴氨酸(1.6％)飼料，其他營養(yǎng)成分均按常規(guī)標準給予，喂養(yǎng)8w，自由進食。
　　(3)自第9周開始，給予每組大鼠2H2O以標記血液游離丙氨酸、血液白蛋白，標記至18周結束。18周內的每周最后一天稱量大鼠體重并記錄每組每周進食量。
　　(4)在8，9，11，13，14，18周處死大鼠，收集血液，作為樣本，用ALB試劑盒檢測血液白蛋白含量，三氯乙酸/乙醇法提純血液白蛋白并用S DS-PAGE電泳鑒定、將提純的白蛋白水解、

5、分離純化其中的丙氨酸、并將丙氨酸衍生，用GC/MS檢測血液白蛋白中的2H-丙氨酸的豐度和血漿游離丙氨酸中2H的豐度。
　　(5)分別繪制各組大鼠血液白蛋白中2H示蹤劑的變化趨勢圖，計算2H標記白蛋白的代謝動力學方程和蛋白質的合成率，比較不同膳食賴氨酸組所得結果的異同，分析不同賴氨酸攝入水平對機體白蛋白代謝動力學具有怎樣的影響。
　　結果:
　　第一部分
　　腹腔注射重水90min后，3只大鼠血漿白蛋白中丙氨酸衍生

6、物的分子量為144、159基團的豐度均可測出，且結果具有一致性。
　　第二部分
　　(1)經檢測，三種飼料中賴氨酸含量分別為:0.23g/100g、0.89 g/100g、1.61 g/100g，符合實驗要求。
　　(2)低劑量賴氨酸能明顯減少大鼠的進食量，高劑量賴氨酸組大鼠的進食量與正常賴氨酸組無差別。
　　(3)三組大鼠體重均值具有顯著性差異，由小到大排序依次為:低劑量賴氨酸組，正常劑量賴氨酸組，高劑量賴氨酸

7、組。
　　(4)低劑量賴氨酸組血漿白蛋白含量與正常劑量賴氨酸組無差別，高劑量賴氨酸組血漿白蛋白含量顯著高于正常劑量賴氨酸組和低劑量賴氨酸組。
　　(5)低劑量賴氨酸組的血漿白蛋白分數合成率為13.8％，正常劑量賴氨酸組血漿白蛋白分數合成率為15.3％，高劑量賴氨酸組血漿白蛋白分數合成率為35.5％。
　　(6)白蛋白合成動力學方程為:低劑量賴氨酸組ft=1.0737×(1-e0.138t);正常劑量賴氨酸組ft=1.0

8、510×(1-e0.153t);高劑量賴氨酸組ft=0.9878×(1-e-0.355t)。
　　結論:
　　(1)腹腔注射重水90min后，即能檢測出血漿白蛋白中的丙氨酸被氘標記，說明該方法能夠成功標記血漿白蛋白，符合本研究需要。
　　(2)在18周實驗期內，以正常賴氨酸(0.9％)攝入量大鼠的血漿白蛋白分數合成率為對照，低賴氨酸(0.2％)攝入量使大鼠血漿白蛋白分數合成率略有降低，高賴氨酸(1.6％)攝入量會明顯提