基于細(xì)菌群體感應(yīng)的自殺基因回路的數(shù)學(xué)建模及其穩(wěn)定性研究.pdf

1、細(xì)菌的自殺行為是自然界的一種常見現(xiàn)象，它是原核生物的一種程序性死亡機(jī)制。群體感應(yīng)（quorum sensing,QS）是細(xì)菌細(xì)胞間的一種通訊形式。細(xì)胞合成并分泌信號(hào)分子，當(dāng)環(huán)境中的信號(hào)分子濃度達(dá)到一定閾值時(shí)，一系列基因被激活，細(xì)菌種群會(huì)同步化地實(shí)現(xiàn)某些功能和行為上的改變?；谌后w感應(yīng)的自殺基因回路已經(jīng)構(gòu)建，對(duì)這一基因回路的系統(tǒng)研究和精確調(diào)控在理論和應(yīng)用上都具有重要意義。
　　本論文以合成生物學(xué)的研究思路，以基于群體感應(yīng)LuxR-L

2、uxI體系的自殺基因回路為研究對(duì)象，將數(shù)學(xué)建模和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)合起來(lái)，模擬種群的生長(zhǎng)和自殺行為，分析誘導(dǎo)劑IPTG濃度、pH值、溫度、營(yíng)養(yǎng)條件等因素對(duì)系統(tǒng)行為的影響，目的是實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)回路的長(zhǎng)期、穩(wěn)定、可控的運(yùn)行。本文還深入探討了營(yíng)養(yǎng)條件對(duì)群體感應(yīng)Plux啟動(dòng)子的影響，發(fā)現(xiàn)了啟動(dòng)子上游兩個(gè)調(diào)控序列對(duì)該啟動(dòng)子復(fù)雜微妙的調(diào)控機(jī)制，從而深化了對(duì)細(xì)菌群體感應(yīng)的認(rèn)識(shí)。
　　本論文建立的基因回路安裝在pPopctrl質(zhì)粒上，含有該質(zhì)粒的大腸桿菌

3、在有IPTG存在時(shí)會(huì)分泌一種信號(hào)分子（acyl-homoserine lactone,AHL），當(dāng)AHL積累到一定閾值時(shí)會(huì)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子LuxR，并使之活化為L(zhǎng)uxR*。后者啟動(dòng)Plux啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，CcdB毒蛋白表達(dá)并殺死細(xì)胞。本文通過(guò)常微分方程構(gòu)建數(shù)學(xué)模型來(lái)研究菌群的生長(zhǎng)和自殺行為。模型以 IPTG濃度、pH值、溫度以及營(yíng)養(yǎng)條件為自變量，以不同時(shí)間點(diǎn)菌液的菌落形成單位（colony forming unit，CFU）為因變量，模型與實(shí)

4、驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合良好。對(duì)各參數(shù)的獨(dú)立分析表明：IPTG濃度與LuxR蛋白生成量正相關(guān)，IPTG濃度越高，LuxR*越多，Plux啟動(dòng)子啟動(dòng)越頻繁，自殺越劇烈。pH值影響AHL分子的降解常數(shù)，pH值越大，AHL分子降解越快，信號(hào)分子濃度越低，自殺強(qiáng)度變小。溫度影響細(xì)菌的比生長(zhǎng)速率以及LuxR*的解離常數(shù)，30℃時(shí)，比生長(zhǎng)速率較慢，但LuxR*蛋白最穩(wěn)定，細(xì)菌的自殺行為顯著強(qiáng)于37℃。
　　營(yíng)養(yǎng)條件對(duì)基因回路的運(yùn)行和細(xì)菌種群的自殺行為有重要

5、影響。在貧營(yíng)養(yǎng)的M9培養(yǎng)基中，幾乎觀察不到自殺現(xiàn)象，這暗示著群體感應(yīng)潛在具有未知的、與營(yíng)養(yǎng)水平相關(guān)的調(diào)控機(jī)制。為此，本文將Plux啟動(dòng)子下游的ccdB基因替換為綠色熒光蛋白基因，觀察不同培養(yǎng)基、不同調(diào)控序列作用下的熒光表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：野生型啟動(dòng)子Plux是弱的組成型啟動(dòng)子，有本底水平表達(dá)的能力，但其表達(dá)量幾乎可以忽略，其主要依賴轉(zhuǎn)錄因子LuxR*的調(diào)控才能啟動(dòng) GFP的大量表達(dá)。在啟動(dòng)子Plux上游存在luxbox序列和crp序

6、列兩個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域。在一般情況下，Plux啟動(dòng)子由與luxbox序列相關(guān)的luxR/I系統(tǒng)來(lái)調(diào)控，符合群體感應(yīng)系統(tǒng)所介紹的調(diào)節(jié)規(guī)律。但當(dāng)缺乏碳源或者營(yíng)養(yǎng)匱乏時(shí)，cAMP升高，與cAMP結(jié)合蛋白結(jié)合生成cAMP-CRP蛋白復(fù)合物，此復(fù)合物能結(jié)合在crp序列上，在無(wú)AHL信號(hào)分子時(shí)，也能啟動(dòng)Plux。在有AHL存在時(shí)，CRP復(fù)合物與crp序列的結(jié)合反而阻抑luxbox與啟動(dòng)子Plux結(jié)合以及自身本底水平的表達(dá)。
　　本文建立的常微分方