盤羊-綿羊異種核移植技術(shù)程序的優(yōu)化研究.pdf

1、南京農(nóng)業(yè)大學博士學位論文盤羊綿羊異種核移植技術(shù)程序的優(yōu)化研究姓名：潘曉燕申請學位級別：博士專業(yè)：動物遺傳育種與繁殖指導教師：郭志勤王鋒20080601盤羊一綿羊異種核移植技術(shù)程序的優(yōu)化研究色體，4—26號為端著絲粒染色體；x染色體為最大的端著絲粒染色體，Y染色體為最小的中著絲粒染色體。2盤羊異種重構(gòu)胚的構(gòu)建本試驗比較了綿羊卵巢不同的保存溫度、時間與保存液對卵母細胞孤雌發(fā)育能力的影響。結(jié)果表明，14～18℃保存1517h的卵巢卵母細胞的成

2、熟率(809％VS822％)、孤雌激活后囊胚的發(fā)育率(21O％VS22O％)與對照組間均無顯著差異，采用生理鹽水或DPBS保存卵巢對卵母細胞的發(fā)育亦無顯著影響；而將卵巢在4℃或25～30“C保存15～17h卻顯著降低了卵母細胞的成熟率(619％VS19％)與卵裂率(86％VS91％)，沒有發(fā)育到囊胚從而得出，14～18“C的保存溫度對卵巢的長時間保存是比較適宜的受體卵母細胞去核是核移植關(guān)鍵步驟之一盲吸法是最常采用的去核方法，化學輔助去核

3、法則是利用秋水仙素處理卵母細胞，從而使卵母細胞形成一個包含濃縮染色體的胞質(zhì)突起，利用去核針將其吸除，以達到去核目的本文比較了在化學輔助去核法中，秋水仙素的濃度和作用時間對顯示效果的影響；且對兩種去核法的去核效率進行了探討。結(jié)果表明：(1)成熟的卵母細胞在04“g／mL的秋水仙素溶液中分別孵育05h和1h，胞質(zhì)突起率和去核率沒有顯著的差異，突起率可高達854％，去核率達到100％(2)分別用O2Ⅳg／mL和O4“g／mL秋水仙素對卵母細胞

4、處理05h，均能達到有效去核的目的。(3)卵母細胞體外成熟18～23h，不會影響秋水仙素誘導胞質(zhì)突起的比率和去核率；且對成熟21～23h的卵母細胞采用化學輔助去核法去核，去核率顯著高于盲吸去核法(4)對成熟18～20h的卵母細胞進行盲吸法或化學輔助法去核，重構(gòu)胚的發(fā)育率沒有顯著差異。由此可見，化學輔助去核法(02g／mL的秋水仙素處理05h)可以高效快速地去核，且不影響重構(gòu)胚的早期發(fā)育。另外，本試驗還比較了不同的電融合程序、激活方法和胚

5、胎培養(yǎng)液對異種重構(gòu)胚發(fā)育的影響。結(jié)果顯示：異種重構(gòu)胚的適宜電融合參數(shù)為2個121～125v／m、40ps／次的直流電脈沖或2個126～130V／m、20us／次的直流電脈沖；融合后，對未融合的重構(gòu)胚以同樣的融合參數(shù)再融合一次，不會影響重構(gòu)胚的發(fā)育率，可得到更多的可用異種核移植胚胎。卵母細胞成熟培養(yǎng)25h和26h激活組的囊胚率顯著高于成熟培養(yǎng)24h激活組；6一DidAP激活液作用2h，激活效果較好：分別采用EH6DMAP或Iono6DMA