TNF-α在NK-T細(xì)胞淋巴瘤吉西他濱耐藥中作用的研究.pdf

1、背景：
　　淋巴瘤(Lymphoma)是淋巴細(xì)胞來源的淋巴造血系統(tǒng)的惡性疾病。依據(jù)腫瘤細(xì)胞及組織的病理類型，可主要分為霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’slymphoma, HL)和非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’slymphoma,NHL)兩類型。結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤(extranodal NK/Tcell lymphoma,ENKTCL)作為非霍奇金淋巴瘤的一個(gè)特殊的亞型，具有獨(dú)特的流行病、病理和臨床特點(diǎn)。其在歐美國家罕

2、見，而在東亞及拉丁美洲常見，中青年男性發(fā)病率高。腫瘤常常累及淋巴結(jié)外，鼻咽部常見，其他部位如腭部、扁桃體、咽喉等上呼吸消化道可見，非上呼吸消化道如肺、皮膚、睪丸等罕見。其侵襲性強(qiáng)，病程進(jìn)展快，預(yù)后極差。研究顯示其病因與EB病毒感染相關(guān)，國際尚無明確的標(biāo)準(zhǔn)治療方案。常規(guī)非霍奇金淋巴瘤治療方案，如含阿霉素的CHOP方案可使細(xì)胞耐藥導(dǎo)致效果不佳，近年來含門冬酰胺酶、吉西他濱等藥物的治療方案展現(xiàn)出一定的效果，但仍有部分患者表現(xiàn)為復(fù)發(fā)難治。探索E

3、NKTCL耐藥機(jī)制對(duì)提高患者療效、改善患者生存具有重要作用，使得對(duì)其研究迫在眉睫。
　　近年來，“種子（腫瘤）與土壤（微環(huán)境）”學(xué)說愈發(fā)引起關(guān)注。微環(huán)境通過與腫瘤細(xì)胞的相互作用，促進(jìn)細(xì)胞的增殖、躲避及耐受有害刺激，導(dǎo)致腫瘤的形成和耐藥。腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）作為微環(huán)境中細(xì)胞因子的重要一員，在腫瘤的形成及抑制中均表現(xiàn)出一定作用。TNF-α是最早發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，由活化的巨噬細(xì)胞分泌

4、產(chǎn)生，在炎癥中發(fā)揮重要作用。目前對(duì)于TNF-α的研究多在自身免疫性疾病領(lǐng)域，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)制性脊柱炎和炎癥性腸病等，針對(duì)腫瘤的研究少見。最新研究顯示TNF-α聯(lián)合阿霉素可抵抗乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞株MCF-7/Adr的耐藥作用，并且提高乳腺癌放化療療效。我們的前期研究證實(shí)TNF-α在結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者血清中較正常人明顯降低，提示其可能為ENKTCL的保護(hù)性因素。關(guān)于TNF-α在ENKTCL耐藥中的作用，尚未有研究報(bào)道。NF-κB

5、通路作為近年來研究的熱點(diǎn)通路，其激活與炎癥及腫瘤密切相關(guān)，主要通過經(jīng)典途徑和旁路途徑激活NF-κB蛋白，轉(zhuǎn)入胞核結(jié)合靶基因中的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子，誘導(dǎo)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，在NK/T細(xì)胞淋巴瘤耐藥中可能發(fā)揮著重要的作用。
　　本實(shí)驗(yàn)以NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株YTS為研究對(duì)象，采用低濃度梯度遞增聯(lián)合大劑量間斷沖擊方法建立耐吉西他濱（Gemcitabine,Gem）的YTS細(xì)胞系（YTS/Gem），在Gem及TNF-α兩因素作用下，分別采

6、用CCK8、細(xì)胞流式及Western blot方法對(duì)比YTS及YTS/Gem細(xì)胞增殖、周期變化及相關(guān)蛋白表達(dá)情況，初步探索TNF-α在結(jié)外NK/T細(xì)胞淋巴瘤耐藥中發(fā)揮的作用。
　　目的：
　　以NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株YTS為研究對(duì)象，建立耐吉西他濱（Gemcitabine，Gem）的YTS細(xì)胞系（YTS/Gem），對(duì)比YTS及YTS/Gem在Gem及TNF-α兩因素作用下細(xì)胞增殖、周期變化及相關(guān)蛋白表達(dá)情況，探索TNF-α

7、在結(jié)外NK/T淋巴瘤耐藥中作用。
　　方法：
　　1.細(xì)胞的體外培養(yǎng)：YTS細(xì)胞以1640培養(yǎng)基中加入10％胎牛血清為培養(yǎng)液；YTS/Gem細(xì)胞以1640培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清及一定濃度的Gem為培養(yǎng)液。每2-3天對(duì)細(xì)胞更換或者添加適量培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱，適宜條件（37℃、5％CO2）下培養(yǎng)。
　　2.YTS/Gem細(xì)胞的構(gòu)建：對(duì)YTS細(xì)胞使用Gem低濃度梯度遞增聯(lián)合大劑量間斷沖擊方法誘導(dǎo)其產(chǎn)生耐藥，建立可穩(wěn)定傳代

8、的耐Gem的 YTS細(xì)胞株（YTS/Gem）。
　　3.耐藥指數(shù)的測(cè)定：在96孔板中以不同濃度Gem（0、5、10、20、40、80nM）處理YTS細(xì)胞和YTS/Gem細(xì)胞，設(shè)3個(gè)復(fù)孔；采用CCK8法，利用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)在450nm時(shí)的吸光度，獲得相應(yīng)OD值，計(jì)算YTS細(xì)胞和YTS/Gem細(xì)胞的IC50值，重復(fù)測(cè)量三次，求得YTS/Gem細(xì)胞的耐藥指數(shù)。
　　4.實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)YTS、YTS/Gem細(xì)胞，分別進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)分組：

9、
　?、賹?duì)照組：將YTS細(xì)胞或YTS/Gem細(xì)胞在培養(yǎng)液中培養(yǎng)48h；
　?、赥NF-α組：將YTS細(xì)胞或YTS/Gem細(xì)胞在含TNF-α20ng/ml濃度培養(yǎng)液中培養(yǎng)48h；
　?、跥em組：將YTS細(xì)胞或 YTS/Gem細(xì)胞分別在含 Gem20nM濃度培養(yǎng)液中培養(yǎng)48h；
　　④Gem+TNF-α組：將YTS細(xì)胞或YTS/Gem細(xì)胞在含TNF-α20ng/ml濃度及Gem20nM濃度培養(yǎng)液中培養(yǎng)48h。

10、>　　5.細(xì)胞增殖的檢測(cè)：采用CCK8法，在96孔板分設(shè)3個(gè)復(fù)孔，利用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)在450nm時(shí)的吸光度，獲得相應(yīng)OD值，比較YTS細(xì)胞及YTS/Gem細(xì)胞在TNF-α組、Gem組及Gem+TNF-α組增殖活性的改變。
　　6.Western blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白：對(duì)YTS和YTS/Gem細(xì)胞的對(duì)照組、TNF-α組、Gem組及Gem+TNF-α組分別檢測(cè)NF-κB通路中磷酸化NF-κB（p-p65）蛋白、總NF-κB（p65）

11、蛋白表達(dá)情況。
　　7.流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期：對(duì)YTS/Gem細(xì)胞，使用流式細(xì)胞技術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）比較TNF-α組、Gem組及Gem+TNF-α組細(xì)胞周期的改變。
　　8.使用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和繪圖，數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x?s）顯示。兩組不同數(shù)據(jù)比較如果其方差齊，使用t檢驗(yàn)，如方差不齊，使用t’檢驗(yàn)。多組不同數(shù)據(jù)間的比較即選取單因素方差方法分析，多樣本不同均數(shù)其兩兩比較即采

12、用LSD-t檢驗(yàn)。p<0.05表示差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.成功構(gòu)建了NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的吉西他濱耐藥株YTS/Gem。吉西他濱對(duì)YTS細(xì)胞和YTS/Gem細(xì)胞的IC50值分別為（18.09±1.67）nM和（314.90±5.62）nM，YTS/Gem細(xì)胞株耐藥指數(shù)達(dá)到了17.41。
　　2.TNF-α促進(jìn)YTS/Gem細(xì)胞的增殖：
　　（1）在TNF-α作用下，TNF-α組與對(duì)照組相

13、比，TNF-α對(duì)YTS細(xì)胞作用不明顯（p>0.05），卻使YTS/Gem細(xì)胞存活率提高（p<0.05）。
　?。?）在TNF-α與Gem作用下，Gem+TNF-α組與Gem組相比， TNF-α對(duì)YTS細(xì)胞作用不明顯（p>0.05），卻使YTS/Gem細(xì)胞存活率提高（p<0.05）。
　　3.TNF-α使YTS/Gem細(xì)胞的NF-κB通路激活：在YTS/Gem細(xì)胞中，TNF-α組與對(duì)照組相比，TNF-α使磷酸化NF-κB（p-

14、p65）蛋白表達(dá)增高，而總NF-κB（p65）蛋白表達(dá)無明顯變化；Gem+TNF-α組與Gem組相比，TNF-α使磷酸化NF-κB（p-p65）蛋白表達(dá)增高，而總NF-κB（p65）蛋白表達(dá)無明顯變化。
　　4.TNF-α對(duì)YTS/Gem細(xì)胞周期無影響：在YTS/Gem細(xì)胞中：TNF-α組與對(duì)照組相比，TNF-α使 G0/G1期細(xì)胞比例減少、S期細(xì)胞比例增多，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)；Gem+TNF-α組與Gem組相比，T