他汀類(lèi)藥物對(duì)NK-T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的研究.pdf

1、背景：
　　惡性淋巴瘤(Malignantlymphoma,ML)為源自于淋巴結(jié)與其他淋巴造血組織的惡性腫瘤，可分為霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’Slymphoma,HL)與非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’Slymphoma,NHL)。其發(fā)病率女性和男性的分別居全球第全世界第五和第六位，該病已經(jīng)嚴(yán)重威脅到人類(lèi)的健康。
　　NK/T細(xì)胞淋巴瘤(NK/T-CellLymphoma,NKTCL)則為非霍奇金淋巴瘤的一個(gè)類(lèi)型

2、，其發(fā)病率高，且分布具有一定的地域特點(diǎn)，主要在亞洲分布，且歐美發(fā)病人群也多為亞裔，并因腫瘤組織來(lái)源于NK細(xì)胞或者T細(xì)胞而得名。腫瘤較常累及淋巴結(jié)以外組織，比如鼻腔及鼻咽，其他部位如扁桃體、上顎等上呼吸道或者消化道也可發(fā)生，此外還可以累及皮膚、睪丸、腦及骨髓等，病情嚴(yán)重者可能出現(xiàn)嗜血細(xì)胞綜合征，引起嚴(yán)重的臨床的癥狀，例如全血細(xì)胞的減少、肝臟和脾臟的腫大、高熱、黃疸以及多個(gè)器官的功能的損害。該類(lèi)型淋巴瘤常侵犯血管，并能夠釋放穿孔素，故會(huì)有大

3、量骨、軟組織等壞死穿孔，引起相應(yīng)臟器不可逆的功能障礙。該病的病因不確切，大量研究發(fā)現(xiàn)與EB病毒的慢性的感染密切相關(guān)。該病具有侵襲程度高，進(jìn)展快速，預(yù)后差，生存期短等特點(diǎn)，即使達(dá)到完全緩解，后期很容易復(fù)發(fā)。疾病的早期大多預(yù)后較好，而中晚期患者則預(yù)后差，治療也不確切。國(guó)際上目前尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)的一線(xiàn)治療方案，近年來(lái)，隨著研究的進(jìn)展，以吉西他濱、培門(mén)冬酶為基礎(chǔ)的DDGP化療方案對(duì)NKTCL的療效有了顯著的提高。而NKTCL細(xì)胞多表達(dá)一些耐藥的基因的m

4、RNA，這種基因的產(chǎn)物如P糖蛋白則可以與一些化療藥物相結(jié)合，從而導(dǎo)致相應(yīng)的治療效果不理想。
　　他汀類(lèi)的藥物為3-羥基-3甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）的還原酶抑制劑，能夠阻斷甲羥戊酸的途徑，該藥物可減低膽固醇濃度，保護(hù)心血管系統(tǒng)。甲羥戊酸途徑是維持細(xì)胞代謝活性的一個(gè)重要的細(xì)胞內(nèi)通路，該途徑的終產(chǎn)物包括膽固醇和多萜醇等。近年來(lái)，一些實(shí)驗(yàn)室和臨床數(shù)據(jù)證明，他汀類(lèi)藥物除了能夠降低膽固醇濃度，還對(duì)別的疾病的防治有利，例如，顯著改善血

5、管的內(nèi)皮功能或穩(wěn)定血管壁動(dòng)脈粥樣硬化的斑塊、對(duì)抗炎癥和免疫調(diào)節(jié)作用、保護(hù)神經(jīng)、抗腫瘤、減少慢性腎臟病進(jìn)展，其中抗腫瘤的特性也成為研究的熱點(diǎn)。他汀類(lèi)的抗癌特性在很多腫瘤細(xì)胞上都有研究，例如乳腺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、白血病等。不僅如此，現(xiàn)有一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和前瞻性的臨床試驗(yàn)，也證實(shí)了他汀類(lèi)的藥物能夠降減少腫瘤發(fā)病率、降低腫瘤的發(fā)展、減慢其轉(zhuǎn)移速度、逆轉(zhuǎn)腫瘤的耐藥等。
　　他汀類(lèi)的藥物抗腫瘤的效果與藥物的極性有很大的關(guān)系

6、，親脂性越強(qiáng)的他汀，越容易夸越細(xì)胞膜，作用于細(xì)胞內(nèi)各種代謝途徑，也表現(xiàn)出更為強(qiáng)烈的抗癌特性。其抑制腫瘤增殖主要通過(guò)兩個(gè)方面的作用，包括細(xì)胞周期的阻滯以及誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。大量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)告訴我們此類(lèi)的藥物可以使細(xì)胞周期停滯在G1/S期邊界。細(xì)胞凋亡存在兩種途徑發(fā)生，包括內(nèi)在和外源性的途徑，該類(lèi)型的藥物可以同時(shí)作用于這兩種途徑。內(nèi)源性途徑（線(xiàn)粒體途徑）誘導(dǎo)的細(xì)胞的凋亡主要以Bcl-2家族的抗凋亡的蛋白及其前體的不平衡為表現(xiàn)，外源性途徑主要表現(xiàn)

7、為caspase-3、caspase-8、caspase-9的活化。在乳腺癌、前列腺癌、白血病等一系列的細(xì)胞中，均已發(fā)現(xiàn)他汀類(lèi)藥物可以誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。
　　本研究以NKTCL細(xì)胞株YTS和NKL做為研究對(duì)象，用不同的濃度的辛伐他?。⊿imvastatin,SIM）和FLU（Fluvastatin,FLU）作用于細(xì)胞株，使用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞的增長(zhǎng)和抑制情況，用流式細(xì)胞儀（FlowCytometer,FCM）檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞周期的影響

8、，利用AnnexinV-PI方法和Westernblot法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。后將FLU與GEM（Gemcitabine,GEM）聯(lián)合，并使用CCK8及Westernblot來(lái)檢測(cè)兩種藥物作用后對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響。希望經(jīng)過(guò)此次研究，可以了解他汀類(lèi)的藥物對(duì)NKTCL細(xì)胞是否有生長(zhǎng)抑制作用，能否與細(xì)胞毒藥物GEM聯(lián)合協(xié)同地抗腫瘤，找到更為有效的治療該疾病的方法。
　　目的：
　　研究辛伐他汀和氟伐他汀對(duì)NKTCL細(xì)胞株YTS

9、和NKL細(xì)胞增殖抑制的影響，并探索與吉西他濱聯(lián)合用藥的效果。
　　材料和方法：
　　1.細(xì)胞的培養(yǎng)：YTS在含有10％的胎牛血清的1640培養(yǎng)基，NKL在含有10%的胎牛血清和白細(xì)胞介素-2中培養(yǎng)基，并放置于溫度為37℃、含有5％CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每2-3天根據(jù)細(xì)胞狀況更換或者添加適量培養(yǎng)液。
　　2.CCK8檢測(cè)：CCK8法檢測(cè)不同濃度SIM和FLU作用后細(xì)胞增殖抑制水平以及FLU與GEM聯(lián)合前后細(xì)胞的增殖抑

10、制的水平。不同濃度SIM（0、5、10、25、50uM）以及FLU（0、5、10、25、50uM），分別作用YTS、NKL及正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別作用48和72小時(shí)。與GEM聯(lián)合的實(shí)驗(yàn)分組：（0、FLU2.5uM、FLU5uM、GEM20nM、GEM20nM+FLU2.5uM、GEM20nM+FLU5uM）作用于YTS48小時(shí)，（0、FLU2.5uM、FLU5uM、GEM2nM、GEM2nM+FLU2.5uM、GE

11、M2nM+FLU5uM）作用于NKL48小時(shí)。利用酶標(biāo)儀來(lái)測(cè)定波長(zhǎng)在450nm時(shí)的吸光度，得到相應(yīng)的OD值，記錄并計(jì)算平均值。
　　3.FCM檢測(cè)細(xì)胞周期：不同濃度FLU（0、5、25uM）作用于兩株細(xì)胞株48小時(shí)后，按照測(cè)細(xì)胞周期的試劑盒來(lái)檢測(cè)用藥前后細(xì)胞周期的阻滯的情況。
　　4.AnnexinV-PI檢測(cè)凋亡：FLU（0、5uM、25uM）作用于兩株細(xì)胞48小時(shí)后，利用AnnexinV-FITC的方法檢測(cè)藥物誘導(dǎo)的凋亡

12、的水平。按照相關(guān)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。
　　5.Westernblot法檢測(cè)凋亡的相關(guān)蛋白：YTS和NKL兩種細(xì)胞株在相同劑量的SIM和FLU（10uM）作用48小時(shí)后檢測(cè)Cleavedcaspase-3、Cleavedcaspase-9的表達(dá)情況；FLU5uM、GEM20nM、GEM20nM+FLU5uM作用于YTS細(xì)胞株48小時(shí)，F(xiàn)LU5uM、GEM2nM、GEM2nM+FLU5uM作用于NKL細(xì)胞株48小時(shí)，后檢測(cè)Cleaved

13、caspase-3、Cleavedcaspase-9蛋白的表達(dá)情況。
　　6.采用SPSS21.0軟件統(tǒng)計(jì)分析和繪圖。各組的數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。兩組數(shù)據(jù)的比較若方差齊，則采用t檢驗(yàn)，若方差不齊，則采用t’檢驗(yàn)。多組數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析，多樣本均數(shù)的兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05則認(rèn)為有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　1.SIM和FLU能夠抑制YTS和NKL的細(xì)胞生長(zhǎng)：SIM(5、10、2

14、5、50uM)對(duì)YTS細(xì)胞作用48小時(shí)后細(xì)胞的存活率由（92.30±1.07）%下降到（71.04±1.40）%,作用72小時(shí)后細(xì)胞的存活率分別為由（74.39±2.35）%下降到（54.12±2.83）%；（2）FLU(5、10、25、50uM)對(duì)YTS細(xì)胞作用48小時(shí)后細(xì)胞的存活率由（74.75±3.25）%下降到（28.67±1.16）%,作用72小時(shí)后細(xì)胞的存活率由（53.44±2.81）%下降到（24.26±3.21）%；（3

15、）同等濃度梯度的SIM對(duì)NKL細(xì)胞作用48小時(shí)后細(xì)胞的存活率由（84.29±2.61）%下降到（70.82±2.56）%,作用72小時(shí)后細(xì)胞的存活率由（76.62±2.84）%下降到（40.97±2.23）%；（4）同等濃度梯度的FLU對(duì)NKL細(xì)胞作用48小時(shí)后細(xì)胞的存活率由（68.68±1.75）%下降到（29.86±1.61）%,作用72小時(shí)后細(xì)胞的存活率由（39.89±1.31）%下降到（18.54±1.03）%；（5）SIM和F

16、LU對(duì)正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞存活率沒(méi)有顯著影響。
　　2.GEM與FLU聯(lián)合用藥有協(xié)同作用：2.5uMFLU、5uMFLU與20nMGEM聯(lián)合作用YTS48小時(shí)后細(xì)胞抑制率分別為（39.23±1.03）%、（49.81±2.01）%，高于單獨(dú)應(yīng)用FLU（19.96±1.89、25.84±0.12）%及GEM（13.45±0.97）%的增殖抑制率；2.5uMFLU、5uMFLU與2nMGEM聯(lián)合作用NKL48小時(shí)后細(xì)胞抑制率分別為（

17、43.89±1.03）%、（51.68±2.47）%，高于單獨(dú)應(yīng)用FLU（19.60±1.74、31.67±2.01）%及GEM（19.62±1.15）%的抑制率。
　　3.FLU能夠?qū)е录?xì)胞周期的阻滯：FLU（0、5、25uM）作用于YTS48小時(shí)后G0/G1期的細(xì)胞比例由（41.15±4.59）%最大上升至（64.88%±2.17），S期比例由（43.39±5.77）%最大下降至（21.25±4.26）%；同等濃度梯度FLU作

18、用于NKL48小時(shí)后G0/G1期的細(xì)胞比例由（45.37±3.79）%最大上升至（69.59±4.33）%，S期比例由（34.02±6.04）%最大下降至（13.26±0.85）%。
　　4.FLU能夠誘導(dǎo)YTS和NKL的凋亡：（1）FLU作用于YTS和NKL細(xì)胞株后能夠引起細(xì)胞凋亡；（2）FLU5uM、25uM對(duì)YTS細(xì)胞作用48小時(shí)的凋亡率分別為（14.1±2.66）%、（34.5±5.67）%，F(xiàn)LU5uM、25uM對(duì)NKL

19、細(xì)胞作用48小時(shí)的凋亡率分別為（19.83±3.26）%、（37.17±5.62）%。
　　5.FLU、SIM均能夠引起凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的增多，且與GEM有協(xié)同作用：相同劑量的FLU和SIM作用于兩細(xì)胞株，凋亡通路重要蛋白Cleavedcaspase-3、Cleavedcaspase-9的表達(dá)增高，且細(xì)胞對(duì)FLU比對(duì)SIM的反應(yīng)更為敏感。FLU和GEM聯(lián)合應(yīng)用時(shí)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，比單用任何一種藥時(shí)都增多。
　　結(jié)論：