靶向抑制EBV-LMP1對NK-T細胞淋巴瘤放射增敏及抑制侵襲力的作用研究.pdf

1、研究背景與研究目的：
　　結(jié)外NK/T細胞淋巴瘤—鼻型（extranodal natural killer t cell lymphoma,nasal type以下簡稱NKTCL）屬于非霍奇金淋巴瘤，是一類以血管中心性壞死為特點的淋巴瘤，好發(fā)于東亞及南美洲。放射治療仍為NKTCL特別是局限期NKTCL的主要治療方案，然而仍有30％的患者治療效果較差，因為目前對該病缺乏有用的預測放射敏感性的生物學指標，探究能夠預測放射敏感性的分子標

2、記值得我們進一步研究。
　　NKTCL病因尚不明確，但EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV）的感染同該惡性淋巴瘤的發(fā)病關系密切。EB病毒編碼的LMP1（latent membrane protein,LMP1）基因是被證實的的致癌基因，LMP1可在大多數(shù)鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤中表達，因此目前LMP1的研究已成為EBV相關惡性腫瘤特別是淋巴造血系統(tǒng)腫瘤研究的熱點。特異性地阻斷LMP1基因相當于去除EB

3、V的致癌因素，這種治療方式已經(jīng)成為EBV相關腫瘤基因治療的研究方向之一。然而這種治療方式在EBV相關淋巴瘤特別是NKTCL中的研究較少，LMP1基因?qū)KTCL放射敏感性的影響及其分子機制尚無研究。
　　在本課題中，我們選擇LMP1作為NKTCL基因治療的分子靶點，研究利用shRNA干擾技術沉默LMP1基因表達來增加EBV相關淋巴瘤放射敏感性的可行性。我們首先在NKTCL患者組織標本和細胞系檢測LMP1的表達情況，然后構(gòu)建攜帶LM

4、P1cDNA和LMP1shRNA的重組慢病毒表達載體，轉(zhuǎn)染NKTCL細胞株。研究沉默LMP1對NKTCL生長增殖、侵襲轉(zhuǎn)移及放射敏感性等生物學特性的作用，最后檢測凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移及DNA損傷修復相關分子通路基因，探索LMP1在NKTCL中的生物學功能和分子機制，為NKTCL的臨床診治提供分子靶標。
　　第一部分：LMP1在NK/T細胞淋巴瘤的差異表達水平及對其放射敏感性的關系
　　目的：
　　從mRNA和蛋白水平檢測LM

5、P1在NK/T細胞淋巴瘤組織、細胞中的表達水平，并探討其與放療療效的關系。
　　材料與方法：
　　1．收集2013年9月-2015年3月鄭州大學第一附屬醫(yī)院的鼻型NK/T細胞淋巴瘤患者組織活檢新鮮標本40例。檢測組織標本中LMP1的mRNA和蛋白表達水平，根據(jù)放射治療療效將患者分為敏感、中度敏感和不敏感組三組。分析LMP1的表達水平與臨床病理特征及放療療效的關系。另取良性淋巴組織反應性增生標本20例作為對照。
　　2．

6、RT-PCR及Western blot檢測在SNK-6、NKL、NK92、YTS及YT共5個NK/T細胞淋巴瘤細胞系中LMP1基因及蛋白的內(nèi)源性表達。6MV-X射線分別給予0、2、4、6、8Gy的劑量進行放射治療，CCK-8法及克隆形成實驗檢測細胞增殖情況，摸索合適的放療劑量，細胞學水平探索LMP1與放射敏感性差異的相關性。
　　結(jié)果：
　　1．40例NKTCL患者病灶組織中34例RT-PCR檢測到LMP1mRNA，陽性率8

7、5%。對34例患者組織RT-PCR及Western blot發(fā)現(xiàn)，NK/T細胞淋巴瘤組織中LMP1mRNA和蛋白相對表達量均明顯高于良性淋巴組織反應性增生組織(F=248.367，P<0.001)。LMPl表達水平與NKTCL的血清β2-微球蛋白、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、B癥狀密切相關，即β2-微球蛋白異常、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、伴隨B癥狀者，LMPl表達水平高(P<0.01)。單純放療組LMPl表達水平與放療療效密切相關，即LMP1表達水平越高者，放療效

8、果越差(P<0.05)。
　　2．熒光實時定量PCR檢測EBV-LMP1在SNK-6、NKL、YT、YTS、NK-92細胞系中的表達。以NKL細胞的表達為參照組，對結(jié)果通過單因素方差分析顯示：5種細胞株中LMP1的表達量之間具有顯著性差異(P<0.001)。LMP1在SNK-6、YT、YTS、NK-92、NKL中依次降低。統(tǒng)計學顯示SNK-6細胞當中LMP1的表達量最高,且高于YT(P<0.001)、YTS(P<0.001)、NK

9、-92(P<0.001)、NKL(P<0.001)細胞中的表達；LMP1表達較高的是YTS細胞,且高于YT(P<0.05)、NK-92(P<0.00l)、NKL(P<0.001)細胞中的表達;LMP1在YTS中的表達高于NK-92(P=0.032)、NKL(P=0.018)，而LMP1表達較低的NKL與NK-92兩株細胞之間無統(tǒng)計學差異(P=0.741)。對各細胞系分別給予0、2、4、6、8Gy的放療劑量進行照射后，CCK-8及平板克隆

10、形成實驗檢測細胞放射敏感性顯示YT、SNK-6、YTS、NK-92、NKL的放射敏感性依次增加。YT、SNK-6對放療不敏感，YTS對放療中度敏感，而NK-92、NKL對放療高度敏感，差異有統(tǒng)計學意義。細胞中LMP1的表達量越低，其放射敏感性越高。
　　結(jié)論：
　　LMP1的差異表達與NK/T細胞淋巴瘤的放射敏感性負相關。
　　第二部分：慢病毒介導穩(wěn)定過表達及沉默LMP1的NK/T細胞淋巴瘤細胞株的構(gòu)建
　　目的

11、：
　　通過重組慢病毒表達載體構(gòu)建穩(wěn)定高/沉默LMP1的NK/T細胞淋巴瘤細胞株。
　　材料與方法：
　　選擇第一部分所述5種細胞株中LMP1呈中度表達而且具有一定侵襲能力的YTS細胞株，利用慢病毒pCDH-CMV-MCS-EFl-copGFP作為載體，連接LMP1克隆模板PCR產(chǎn)物，形成高表達慢病毒載體pCDH-LMP1。設計并合成三條LMP1基因的shRNA，以干擾慢病毒pLVX-shRNA1為載體，構(gòu)建LMP1基

12、因干擾質(zhì)粒pLVX-LMP1-shRNA a，pLVX-LMP1 shRNA b，及pLVX-LMP1-shRNAc。Real-Time PCR篩選最有效的RNA干擾序列。對過表達及干擾表達LMP1的重組質(zhì)粒質(zhì)粒進行包裝，濃縮及滴度鑒定，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染淋巴瘤細胞，測定慢病毒對淋巴細胞的感染效率。
　　結(jié)果：
　　酶切及測序結(jié)果顯示過表達LMP1重組慢病毒質(zhì)粒pCDH-LMP1及干擾表達LMP1重組慢病毒質(zhì)粒pLVX-LMP1-

13、shRNA a，pLVX-LMP1 shRNA b，pLVX-LMP1-shRNAc構(gòu)建成功。其中pLVX-shRNAa干擾效率最高，選擇其進行第三部分后續(xù)實驗。濃縮后的病毒滴度可達108IFU/ml。轉(zhuǎn)染YTS細胞系后，RT-PCR檢測細胞轉(zhuǎn)染效率，對相對定量結(jié)果進行t檢驗顯示LMP1在pCDH-YTS中的表達要高于YTS/parental中的表達(P=0.006)，結(jié)果具有統(tǒng)計學差異；而LMP1-shRNA-YTS中的表達要低于YT

14、S/parental中的表達(P=0.005)。說明瞬時轉(zhuǎn)染對LMP1的表達產(chǎn)生影響。
　　結(jié)論：
　　成功構(gòu)建穩(wěn)定過表達及沉默LMP1的NK/T細胞淋巴瘤細胞亞株。
　　第三部分：靶向抑制LMP1降低NK/T細胞淋巴瘤侵襲能力并提高其放射敏感性及機制分析
　　目的：
　　探討慢病毒介導的LMP1-shRNA干擾表達載體對NK/T細胞淋巴瘤放射敏感性的影響及機制。
　　方法：
　　采用能夠穩(wěn)定轉(zhuǎn)

15、染傳代6代以上的慢病毒介導干擾LMP1表達的YTS細胞亞細胞株YTS-LMP1-shRNA后進行X線照射，采用CCK-8法和克隆形成實驗檢測放療增敏效果，Millicell小室實驗(侵襲實驗)檢測侵襲能力變化，Western blot檢測與侵襲相關TIMP-1、MMP-9蛋白，DNA損傷修復通路相關蛋白Ku70、DNA-PKcs以及凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax等表達水平的變化，從分子水平分析其放射增敏及抑制侵襲的相關機制。
　　

16、結(jié)果：
　　CCK-8實驗顯示，PCDH-LMP1轉(zhuǎn)染的細胞株與對照組相比,放射敏感性下降(P<0.001)，而LMP1-shRNA轉(zhuǎn)染后的細胞株與對照組相比，放療敏感性增強(P<0.001)?？寺⌒纬蓪嶒烇@示，經(jīng)4GyX線照射后，LMPl-shRNA轉(zhuǎn)染組存活曲線較其他各組均明顯下降(P<0.01)。侵襲實驗顯示，單純照射組、單純轉(zhuǎn)染shLMP1組、照射+轉(zhuǎn)染shLMP1組均明顯少于對照組（P<0.01）；照射聯(lián)合轉(zhuǎn)染shLMP

17、1組較其余各組，穿膜細胞數(shù)均明顯減少（P<0.01）。進一步分析顯示，除Ku-70外，其他入選蛋白在NK/T細胞淋巴瘤中都有或多或少表達，6GyX線照射可誘導YTS細胞凋亡并誘導侵襲相關蛋白MMP-9和相關蛋白Bcl-2表達降低，DNA損傷修復蛋白DNA-PKcs表達增加，而LMPl-shRNA轉(zhuǎn)染可增加放射誘導的細胞凋亡(P<0.01)，并且可上調(diào)YTS細胞自身和放射誘導的Bax、TIMP-1蛋白表達(P<0.01)，下調(diào)自身和放射誘