西達(dá)本胺誘導(dǎo)NK-T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系凋亡的作用研究.pdf

1、背景：
　　NK/T細(xì)胞淋巴瘤（Natural Killer/T cell lymphoma）是EB病毒感染相關(guān)的非霍奇金淋巴瘤，常發(fā)生在亞洲和南美洲的部分地區(qū)且多為亞裔人群。它開始通常表現(xiàn)為上呼吸道感染、鼻炎、膿涕或涕中帶血、中線肉芽腫，逐步侵入鼻腔、鼻咽、腭，使面部皮膚軟組織破壞甚至發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。組織學(xué)上，腫瘤細(xì)胞表達(dá) NK細(xì)胞、T細(xì)胞抗原表型，如胞漿 CD56、CD3ε、CD43、CD45RO、CD2等，同時表達(dá)細(xì)胞毒性相關(guān)

2、蛋白如顆粒酶 B、穿孔素、TIA-1。NK/T細(xì)胞淋巴瘤早期對放療非常敏感，晚期預(yù)后差，以化療為主或酌情加用放療。常用的化療方案有 DDGP(順鉑、地塞米松、吉西他濱、培門冬酶)、改良 SMILE方案（甲氨蝶呤、地塞米松、左旋門冬酰胺酶、依托泊苷、異環(huán)磷酰胺、美司鈉、亞葉酸鈣）等，但目前國際上還沒有統(tǒng)一的治療方案。
　　腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程不僅僅限于DNA層面的改變，也往往伴隨著表觀遺傳修飾的紊亂。表觀遺傳學(xué)涉及的范圍包括DNA甲基

3、化（DNA methylation），基因組印記（genomicimprinting）、組蛋白乙?；揎椀取Ｄ壳把芯康谋容^多的是DNA甲基化和組蛋白乙?；[瘤細(xì)胞中甲基化或者乙?；漠惓？蓪?dǎo)致促癌基因的過表達(dá)和抑癌基因的沉默。近年來研究人員開發(fā)的DNA甲基化酶（DNA methyltransferase,DNMT）抑制劑和組蛋白去乙酰基酶抑制劑（(histone deacetylases inhibitors，HDACIs）可以糾正這

4、種異常。一些表觀遺傳學(xué)藥物已經(jīng)在包括乳腺癌、肺癌、宮頸癌、直腸癌及白血病等癌癥臨床試驗(yàn)和實(shí)際治療中取得了成效。臨床上，常規(guī)化療藥物因其毒副作用或者患者化療耐藥往往療效不盡如人意。當(dāng)前，使用表觀遺傳藥物聯(lián)合常規(guī)化療藥物則可以明顯優(yōu)于單獨(dú)使用常規(guī)藥物的效果。
　　細(xì)胞中乙?；降母叩陀绊懼虻霓D(zhuǎn)錄與相應(yīng)行使生理功能的蛋白的表達(dá)。而組蛋白去乙酰化酶抑制劑能使腫瘤細(xì)胞的異常乙?；癄顟B(tài)得到糾正，改變?nèi)旧|(zhì)緊縮的結(jié)構(gòu)，使得特定的基因轉(zhuǎn)錄，

5、作用于多種信號通路，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。隨著多種組蛋白去乙?；敢种苿┑拈_發(fā)，研究者發(fā)現(xiàn)這種廣譜的新型抗腫瘤藥物可使腫瘤細(xì)胞周期阻滯、抗腫瘤血管生成、通過內(nèi)外源兩種細(xì)胞凋亡途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并且具有抗纖維化和化療增敏的作用。
　　西達(dá)本胺是我國自主研發(fā)的一種HDACI，已在國內(nèi)被批準(zhǔn)用于治療復(fù)發(fā)或難治性外周T細(xì)胞淋巴瘤,目前在多種臨床試驗(yàn)中作為單一藥物或與其他藥物聯(lián)合治療各種血液和實(shí)體腫瘤的研究。吉西他濱(gemcitabine

6、)能夠影響DNA合成。作為一種周期特異性的臨床常見的抗腫瘤藥物，吉西他濱廣泛應(yīng)用于包括實(shí)體瘤、血液腫瘤在內(nèi)的多種腫瘤治療方案中，如晚期胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌、轉(zhuǎn)移性乳腺癌、膀胱癌、早期宮頸癌的新輔助治療等。但在臨床上，吉西他濱的療效在部分患者中效果不佳，考慮腫瘤細(xì)胞對吉西他濱產(chǎn)生耐藥，這就限制了吉西他濱的臨床應(yīng)用。因此，近年來將吉西他濱與其它化療藥物或者表觀遺傳學(xué)藥物聯(lián)合應(yīng)用，取得了較好的臨床療效。如NK/T細(xì)胞淋巴瘤中，將吉西他濱與順鉑

7、、地塞米松、培門冬酶共同應(yīng)用，即 DDGP方案較其它方案預(yù)后明顯改善。吉西他濱聯(lián)合奧沙利鉑最近被推薦用于晚期胰腺癌一線治療無效的患者中。
　　NK/T細(xì)胞淋巴瘤惡性程度高，預(yù)后差，國際上還沒有統(tǒng)一的治療方案，表觀遺傳學(xué)藥物如西達(dá)本胺能否在NK/T細(xì)胞淋巴瘤中發(fā)揮作用，目前研究的比較少。
　　本篇論文將不同濃度的西達(dá)本胺作用于兩種NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系YTS、NKL，分別用CCK8法、流式及Western Blot檢測西達(dá)本

8、胺對兩種細(xì)胞株的增殖、周期及凋亡、線粒體膜電位、信號通路等方面的影響，并在動物模型中進(jìn)行了驗(yàn)證；此外，我們還將原有研究進(jìn)一步拓展，驗(yàn)證DNA損傷劑吉西他濱與表觀遺傳學(xué)藥物西達(dá)本胺聯(lián)合應(yīng)用的效果，采用 CCK8法觀察了不同濃度的兩種藥物互相作用下的協(xié)同效果，并根據(jù)結(jié)果選擇了最適宜的濃度梯度進(jìn)行后續(xù)研究，用同樣的方法檢測了兩種藥物聯(lián)合后對周期、凋亡、線粒體膜電位、DNA損傷等方面影響，探究吉西他濱與西達(dá)本胺協(xié)同作用的機(jī)理，希望本研究能為淋巴

9、瘤的臨床治療提供一種新思路。
　　目的：
　　探索西達(dá)本胺對NKTCL細(xì)胞株YTS及NKL的增殖抑制作用及其機(jī)制，研究吉西他濱聯(lián)合西達(dá)本胺促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用效果。
　　材料和方法：
　　1.培養(yǎng)細(xì)胞：YTS細(xì)胞系的培養(yǎng)基為1640培養(yǎng)基與胎牛血清以9:1的比例混合，NKL細(xì)胞系培養(yǎng)基的配置與YTS略有不同，加入了1,000 U/ml的白細(xì)胞介素2（IL-2），根據(jù)細(xì)胞的狀態(tài)調(diào)整換液時間及凍存時間，在恒溫箱中37℃、

10、5％二氧化碳的條件中培養(yǎng)。
　　2.CCK8法檢測細(xì)胞增殖：每種細(xì)胞系分為組，包括西達(dá)本胺單藥組（0,10μM、20μM、40μM），吉西他濱單藥組5nM、10nM、20nM，及兩藥聯(lián)合組。每組設(shè)3個復(fù)孔，不同組間應(yīng)嚴(yán)格排除混雜因素，接種到每孔的細(xì)胞數(shù)量均為16×104/ml，體積90ul。作用48h后，加入10ul的CCK8試劑，在酶標(biāo)儀450nm波長處檢測吸光度（OD值），再計(jì)算出腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率并繪制出細(xì)胞增殖曲線，觀察

11、效果。兩藥聯(lián)合組需要觀察協(xié)同作用，在這里我們應(yīng)用的是 CalcuSyn軟件(Biosoft, Cambridge, UK)計(jì)算協(xié)同指數(shù) CI(combination index),CI<1, CI=1,和CI>1分別代表在協(xié)同作用，相加作用和拮抗作用。CI值比1越小，協(xié)同作用越強(qiáng)。
　　3.流式細(xì)胞儀檢測凋亡和周期：將兩種細(xì)胞系分為西達(dá)本胺西達(dá)本胺單藥組（0,10μM、20μM、40μM），根據(jù)CCK8法繪制的細(xì)胞增殖曲線及CI指

12、數(shù)確定檢測兩藥聯(lián)合作用的最適宜濃度，即小劑量西達(dá)本胺和小劑量吉西他濱聯(lián)合，分為三組即（西達(dá)本胺10μM，吉西他濱10nM，兩小劑量聯(lián)合組）。依照凱基凋亡檢測試劑盒及周期檢測試劑盒的使用說明書處理各組細(xì)胞，依次上流式進(jìn)行檢測并后續(xù)分析。
　　4.線粒體膜電位檢測：細(xì)胞分組與流式細(xì)胞儀檢測凋亡和周期該步驟的分組相同，用 PBS清洗細(xì)胞后，用羅丹明染色，在培養(yǎng)基孵育半小時后洗去染料，熒光顯微鏡下觀察，注意排除各組間的混雜因素，如細(xì)胞密度

13、、處理手法等。
　　5.Western Blot法檢測周期、凋亡、調(diào)控線粒體膜電位及DNA損傷相關(guān)的蛋白：細(xì)胞分組方法同上，各組細(xì)胞處理48小時后收集清洗細(xì)胞，檢測周期相關(guān)蛋白P21、CDK1，凋亡指標(biāo)cleaved Caspase-3 Caspase-9,和 cleaved PARP，調(diào)控線粒體膜電位相關(guān)蛋白bcl-2，DNA損傷標(biāo)志γH2AX的表達(dá)情況，從基因表達(dá)水平進(jìn)一步驗(yàn)證西達(dá)本胺及兩藥共同作用的途徑機(jī)理。
　　6.

14、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：建立小鼠模型，將荷瘤大小適宜的小鼠分為兩組，生理鹽水組與西達(dá)本胺組（10mg/Kg），觀察瘤體在不同組之間的變化，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：用spss21.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，對于多組數(shù)據(jù)的分析采用單因素方差分析，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.西達(dá)本胺能使兩種NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系的組蛋白H3乙酰化水平上調(diào)，并且呈濃度依賴性；西達(dá)本胺能抑制YTS、NKL細(xì)胞系的增殖，并

15、且呈時間和濃度依賴性；吉西他濱與西達(dá)本胺共同作用于細(xì)胞系，抑制腫瘤增殖的作用明顯增強(qiáng)，CI指數(shù)表明二者低劑量組聯(lián)合應(yīng)用時協(xié)同作用較高劑量組明顯；在細(xì)胞形態(tài)方面，西達(dá)本胺單藥組隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞逐漸明顯。低濃度吉西他濱與低濃度西達(dá)本胺聯(lián)合組較小劑量單藥組細(xì)胞形態(tài)破壞更為明顯。
　　2.西達(dá)本胺能使YTS、NKL細(xì)胞系細(xì)胞周期阻滯在G1期，并伴有P21的上調(diào)及CDK1下調(diào)；兩藥聯(lián)合主要阻滯在S期。
　　3．西達(dá)本胺

16、單藥組隨著藥物劑量增加，細(xì)胞凋亡增加；類似的，兩藥聯(lián)合組較單藥組細(xì)胞凋亡程度更為明顯。相應(yīng)地，凋亡程度越明顯的各組凋亡相關(guān)蛋白cleaved Caspase-3 Caspase-9,和 cleaved PARP表達(dá)增加。
　　4．羅丹明染色后在熒光顯微鏡下觀察，熒光強(qiáng)度與線粒體膜電位變化相關(guān)。西達(dá)本胺單藥組隨著劑量增加，線粒體膜電位變化增加,與之相關(guān)的蛋白bcl-2表達(dá)降低，DNA損傷標(biāo)志γH2AX表達(dá)增加；聯(lián)合組中這種變化更加顯

17、著。
　　5．西達(dá)本胺通過阻斷多種信號通路引起NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系的凋亡，根據(jù) Western Blot結(jié)果顯示這些信號通路包括 JAK- STAT, PI3K/AKT和MAPK/RAS。
　　6.與對照組相比，隨著西達(dá)本胺的作用，小鼠瘤體的增長被抑制。剝離的瘤體可見西達(dá)本胺組的瘤體明顯小于對照組。
　　結(jié)論：
　　1.西達(dá)本胺能抑制NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系的增殖。
　　2.吉西他濱與西達(dá)本胺聯(lián)合應(yīng)用抑