MicroRNA-21與NK-T細(xì)胞淋巴瘤生長(zhǎng)調(diào)控及臨床特征的關(guān)系.pdf

1、目的:通過(guò)研究人NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株SNK-6細(xì)胞及NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者外周血與健康志愿者外周血中miRNA-21表達(dá)量的差異，探究NK/T細(xì)胞淋巴瘤的臨床特征及預(yù)后與miRNA-21的相關(guān)性，以及miRNA-21與SNK-6細(xì)胞株生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)系及作用機(jī)制，以期為NK/T細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)病機(jī)制、治療策略提供理論依據(jù)及研究方向。
　　方法:
　　1、研究對(duì)象:選擇2013年～2015年間入河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院血液內(nèi)科就診并

2、可以收集到完善臨床資料的NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者外周血標(biāo)本，以及采集于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院血液科健康志愿者的外周血標(biāo)本作為對(duì)照組。人NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株SNK-6細(xì)胞獲贈(zèng)于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院張明智教授。
　　2、SNK-6細(xì)胞的培養(yǎng)及傳代:應(yīng)用包含體積分?jǐn)?shù)約為10％人AB型滅活血漿、1000u/ml的人重組白介素-2的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)SNK-6細(xì)胞，并置于培養(yǎng)箱中，以恒溫37℃、飽和濕度及5％CO2條件孵育，48h傳

3、代1次。于細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)良好，懸浮成團(tuán)時(shí)進(jìn)行研究。
　　3、實(shí)驗(yàn)所需基因提取:應(yīng)用miRNA提取盒提取患者、健康志愿者血液標(biāo)本及SNK-6細(xì)胞中的miRNA，以及應(yīng)用總RNA提取盒提取SNK-6細(xì)胞株中的總RNA，后將其反轉(zhuǎn)錄成為相應(yīng)的cDNA置于-20℃冰箱中備用。
　　4、應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)miRNA-21在外周血及SNK-6細(xì)胞中的表達(dá)水平。
　　5、應(yīng)用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)將SNK-6細(xì)胞中的miRNA-21進(jìn)

4、行定向封閉沉默。
　　隨機(jī)將處于同一對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SNK-6細(xì)胞分為空白組、封閉同源性siRNA對(duì)照組和封閉miRNA-21實(shí)驗(yàn)組，設(shè)立封閉同源性siRNA對(duì)照組，以排除轉(zhuǎn)染試劑EndoFectionTM的細(xì)胞毒性對(duì)本實(shí)驗(yàn)影響。
　　空白組正常培養(yǎng)，對(duì)照組細(xì)胞轉(zhuǎn)入siRNA-同源性序列，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)入siRNA-21，同等條件轉(zhuǎn)染48小時(shí)后提取三組細(xì)胞miRNA，再次應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)三組細(xì)胞中miRNA-21表達(dá)高低，明確該

5、條件下轉(zhuǎn)染是否成功。
　　5.1應(yīng)用CCK-8方法觀(guān)察轉(zhuǎn)染成功封閉miRNA-21后實(shí)驗(yàn)組生長(zhǎng)趨勢(shì)。
　　取轉(zhuǎn)染48小時(shí)后三組細(xì)胞，調(diào)整密度為1*105/ml，按100μl/孔接種于U型96孔板，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，孵育48h后各加入10μl的CCK-8試劑，置于37℃、飽和濕度及5％CO2條件的培養(yǎng)箱中孵育，于第30min、1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h在酶標(biāo)儀450nm條件下，測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組的吸光度值(OD值)，進(jìn)行

6、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　5.2應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)沉默miRNA-21前后細(xì)胞中PTEN、PI3K及AKT的mRNA表達(dá)水平的變化。
　　取轉(zhuǎn)染48小時(shí)后細(xì)胞，應(yīng)用總RNA提取盒提取SNK-6細(xì)胞株中的總RNA，再次以RT-PCR方法檢測(cè)PTEN、PI3K、AKT的mRNA表達(dá)量。
　　6、將入組患者外周血miRNA-21表達(dá)量與其主要臨床特征進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　7、將所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)輸入SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行統(tǒng)

7、計(jì)學(xué)分析，P＜0.05，認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。人NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者及健康志愿者外周血兩組miRNA-21基因量根據(jù)正態(tài)分布與否應(yīng)用t檢驗(yàn)或非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)miRNA-21的表達(dá)與NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者臨床特征進(jìn)行應(yīng)用x2檢驗(yàn)等頻率分析。
　　結(jié)果:
　　1、在外周血標(biāo)本中，NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者與健康志愿者組miRNA-21表達(dá)量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.000)，NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者miRNA-21表達(dá)量高于健

8、康志愿者組，NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者外周血中miRNA-21存在異常高表達(dá)。
　　2、在人NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株SNK-6細(xì)胞中，miRNA-21的表達(dá)量與健康志愿者外周血對(duì)照組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.001)，人NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株SNK-6細(xì)胞中miRNA-21的表達(dá)量較高，存在異常高表達(dá)。
　　3、在人NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株SNK-6細(xì)胞中封閉miRNA-21后，CCK-8結(jié)果顯示空白組及封閉同源siRNA對(duì)照組

9、吸光值均與封閉miRNA-21實(shí)驗(yàn)組吸光值存在差異（P=0.001、P=0.003），實(shí)驗(yàn)組SNK-6細(xì)胞增殖活性明顯低于其他兩組。
　　4、在人NK/T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株SNK-6細(xì)胞中封閉miRNA-21后應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)到封閉miRNA-21實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中PTEN的mRNA相對(duì)表達(dá)量較空白對(duì)照組升高，而PI3K、AKT的mRNA相對(duì)表達(dá)量較空白對(duì)照組降低，在NK/T細(xì)胞淋巴瘤中，miRNA-21調(diào)控PTEN-PI3K/A

10、KT通路的活性。
　　5、miRNA-21與NK/T細(xì)胞淋巴瘤臨床特征的分析:miRNA-21表達(dá)量高低與分期、骨髓受累與否、Ki-67、β2-MG、白蛋白水平存在統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。即隨著miRNA-21的表達(dá)越高，疾病分期越晚、骨髓受累幾率增加、Ki-67陽(yáng)性率越高、β2-MG越高、白蛋白水平越低。
　　結(jié)論:
　　1、NK/T細(xì)胞淋巴瘤患者外周血及人NK/T細(xì)胞型淋巴瘤細(xì)胞SNK-6細(xì)胞中miRNA-21表達(dá)量存在異常