轉錄生長因子-β1對牛角膜基質體外三維培養(yǎng)模型中膠原構筑的影響.pdf

1、背景：膠原纖維結構破壞是導致多種疾病發(fā)生發(fā)展的主要原因，包括角膜瘢痕形成。研究膠原纖維的構筑，深入理解角膜瘢痕形成的分子機制，對尋找減少角膜瘢痕化及防治角膜盲具有重要意義。在角膜基質損傷修復過程中，主要的病理性改變是細胞外基質（extracellular matrix，ECM）纖維化，而ECM的異常沉積又以膠原纖維合成異常為主。體外三維培養(yǎng)克服了二維培養(yǎng)難以研究ECM結構的局限性，是研究ECM的有效方法。我們的前期研究成功構建了牛角膜基

2、質細胞體外Pellet三維培養(yǎng)模型，添加轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）于該模型中，可誘導角膜基質細胞在mRNA水平和蛋白水平上表達α-平滑肌肌動蛋白(α-smoothmuscle actin，α-SMA)、Ⅰ型膠原(CollagenⅠ，ColⅠ)、Ⅲ型膠原(CollagenⅢ，ColⅢ)、纖維鏈接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）。本研究應用該培養(yǎng)體系探討TGF-β1對膠

3、原合成及構筑的影響，進一步理解角膜基質瘢痕化的形成。
　　目的：構建牛角膜基質細胞體外Pellet三維培養(yǎng)模型，評估TGF-β1對該培養(yǎng)體系中角膜基質細胞膠原纖維的合成情況（表達量及比例），及評估TGF-β1是否影響該模型新合成膠原的構筑（直徑及空間排列）。
　　方法：利用體外Pellet三維培養(yǎng)模型培養(yǎng)原代牛角膜基質細胞，根據培養(yǎng)液添加TGF-β1質量濃度不同，實驗分為低濃度組(0.5 ng/ml TGF-β1)和高濃度組

4、(1.0 ng/ml TGF-β1)。于實驗第2w、3w、4w時間點，通過免疫熒光化學法檢測細胞中ColⅠ和ColⅢ蛋白的表達;培養(yǎng)2w、4w時于透射電鏡下觀察膠原纖維的形態(tài)、走向及空間排列情況;同時應用Image ProPlus6.0軟件測量ColⅠ和ColⅢ蛋白的相對表達量，及4w時膠原纖維的直徑大小，并對其測量結果進行統(tǒng)計學分析。
　　結果：(1)隨著TGF-β1濃度的增加或培養(yǎng)時間的延長，ColⅠ和ColⅢ蛋白的合成均逐漸

5、增加，具有濃度-相關性及時間-效應關系;(2)無論是高濃度組還是低濃度組，ColⅢ/ColⅠ的比值均下調，呈時間依賴趨勢;且4w時ColⅢ/ColⅠ的比值顯著低于2w;各時間點相比較，高濃度組的比值低于低濃度組的。(3)透射電鏡圖片顯示在培養(yǎng)4w后膠原纖維大量合成，且排列紊亂，高濃度組較為明顯;(4)統(tǒng)計學分析結果示4w時高濃度組纖維直徑明顯較低濃度組粗大，具有濃度-效應關系。
　　結論：含0.5 ng/ml或1.0 ng/ml的