家蠶中一個(gè)新的膜蛋白BmMP160基因的克隆、表達(dá)以及在5齡蠶組織中分布.pdf

1、在對(duì)家蠶蛹期cDNA文庫測(cè)序中，我們篩選到一條cDNA序列，通過生物信息學(xué)分析，推測(cè)可能是家蠶-膜蛋白基因。該基因長(zhǎng)度為726bp，由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，ORF長(zhǎng)483bp，編碼160個(gè)氨基酸殘基，蛋白分子量18.58kD，因此我們將其命名BmMP160(Bombyxmorimembraneprotein160)，GenBank登錄號(hào)為DY231129。將BmMP160與數(shù)據(jù)庫中的蛋白進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該蛋白僅與昆蟲中的一些假想蛋白

2、具有很高的同源性，而在其他種屬中同源性不高。 通過PCR把BmMP160的ORF擴(kuò)增后插入到載體pET-28a(+)的EcoRⅠ和XhoⅠ位點(diǎn)，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-BmMP160，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)PCR、酶切鑒定以及測(cè)序分析證實(shí)重組正確。IPTG誘導(dǎo)后裂解菌作SDS-PAGE分析，在22kD處有一濃集特異性蛋白條帶，與預(yù)期值相符。融合蛋白以不溶性的包涵體的形式存在，超聲波裂解菌體分離包涵體并離

3、心、洗滌；對(duì)包涵體進(jìn)行溶解和梯度透析復(fù)性；采用親和層析純化融合蛋白rBmMP160。以該融合蛋白為抗原免疫新西蘭大白兔，制備了BmMP160多克隆抗體，經(jīng)ProteinAHP凝膠柱純化后，ELISA檢測(cè)該抗體的效價(jià)可達(dá)到1:8000。免疫印跡檢測(cè)顯示該抗體對(duì)BmMP160有特異性識(shí)別能力。免疫印跡檢測(cè)結(jié)果還表明，BmMP160在家蠶五齡幼蟲的頭部、表皮、腸、絲腺、脂肪體、氣門、馬氏管和生殖腺中均有表達(dá)。亞細(xì)胞定位和TIRF結(jié)果表明，Bm