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1、在對家蠶蛹期cDNA文庫測序中,我們篩選到一條cDNA序列,通過生物信息學(xué)分析,推測可能是家蠶-膜蛋白基因。該基因長度為726bp,由3個外顯子和2個內(nèi)含子構(gòu)成,ORF長483bp,編碼160個氨基酸殘基,蛋白分子量18.58kD,因此我們將其命名BmMP160(Bombyxmorimembraneprotein160),GenBank登錄號為DY231129。將BmMP160與數(shù)據(jù)庫中的蛋白進行比對,發(fā)現(xiàn)該蛋白僅與昆蟲中的一些假想蛋白
2、具有很高的同源性,而在其他種屬中同源性不高。 通過PCR把BmMP160的ORF擴增后插入到載體pET-28a(+)的EcoRⅠ和XhoⅠ位點,獲得重組表達質(zhì)粒pET-28a(+)-BmMP160,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),經(jīng)PCR、酶切鑒定以及測序分析證實重組正確。IPTG誘導(dǎo)后裂解菌作SDS-PAGE分析,在22kD處有一濃集特異性蛋白條帶,與預(yù)期值相符。融合蛋白以不溶性的包涵體的形式存在,超聲波裂解菌體分離包涵體并離
3、心、洗滌;對包涵體進行溶解和梯度透析復(fù)性;采用親和層析純化融合蛋白rBmMP160。以該融合蛋白為抗原免疫新西蘭大白兔,制備了BmMP160多克隆抗體,經(jīng)ProteinAHP凝膠柱純化后,ELISA檢測該抗體的效價可達到1:8000。免疫印跡檢測顯示該抗體對BmMP160有特異性識別能力。免疫印跡檢測結(jié)果還表明,BmMP160在家蠶五齡幼蟲的頭部、表皮、腸、絲腺、脂肪體、氣門、馬氏管和生殖腺中均有表達。亞細胞定位和TIRF結(jié)果表明,Bm
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