CoCl-,2-對神經(jīng)型一氧化氮合酶表達(dá)的作用及其調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、目的:缺血性腦損傷是一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，其發(fā)病率，致殘率和復(fù)發(fā)率極高。對其深入研究具有重要的理論和臨床應(yīng)用價(jià)值。神經(jīng)細(xì)胞對缺血十分敏感，神經(jīng)系統(tǒng)很多的疾病的發(fā)生，發(fā)展和缺血過程相關(guān)。在神經(jīng)外科疾病的治療中缺血和低氧也是影響病人預(yù)后的重要因素之一。神經(jīng)型一氧化氮合酶(neuronalnitricoxidesynthase，nNOS)最早發(fā)現(xiàn)于大鼠的小腦組織，現(xiàn)已被證明廣泛的存在于神經(jīng)系統(tǒng)中，在維持神經(jīng)元的功能如神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞，神經(jīng)

2、元發(fā)育，突觸塑形，調(diào)節(jié)基因表達(dá)等方面發(fā)揮重要的作用，同時(shí)參與許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理過程。除了神經(jīng)系統(tǒng)外，還在其他很多組織如骨骼肌，肺，腎臟中發(fā)現(xiàn)了nNOS的表達(dá)。nNOS在體內(nèi)具有多樣而復(fù)雜的功能，它的基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)調(diào)節(jié)也十分復(fù)雜。一氧化氮合酶尤其是神經(jīng)型一氧化氮合酶在神經(jīng)系統(tǒng)缺血過程中起到重要作用。但是現(xiàn)在對它在神經(jīng)系統(tǒng)缺血中的作用和調(diào)控的研究存在較大的分歧。我們的研究擬通過低氧化學(xué)模擬物CoCl2刺激神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH，進(jìn)而

3、探討nNOS在模擬低氧條件下的表達(dá)情況和調(diào)控機(jī)制。預(yù)適應(yīng)是機(jī)體抗缺氧或缺血的一種內(nèi)源性保護(hù)現(xiàn)象，在多種動物的心臟，肝、腎和腦等多種組織、器官和細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)了這種機(jī)制的存在，其中在心臟和腦中這種現(xiàn)象受到特別的關(guān)注。有研究認(rèn)為nNOS在低氧預(yù)適應(yīng)中起到重要作用，我們擬通過低氧的化學(xué)模擬物CoCl2刺激神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH建立預(yù)適應(yīng)模型，進(jìn)而研究nNOS在低氧預(yù)適應(yīng)中的作用，并對其預(yù)適應(yīng)的機(jī)制進(jìn)行初步研究。 材料與方法:1.實(shí)驗(yàn)

4、材料：RNA提取試劑TRIzolReagent購自GIBCOBRL，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega，Real-timePCR試劑盒購自Takara，一氧化氮熒光染料DAF-Ⅱa購自Anxora，Real-timePCR相關(guān)引物和探針購自上海博亞生物技術(shù)有限公司，人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SK-N-SH購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所，PCR產(chǎn)物純化試劑盒及柱離心膠回收純化試劑盒均購自上海華舜生物工程有限公司丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺購自MERC

5、K公司產(chǎn)品，瓊脂糖購自Promega公司，載體連接系統(tǒng)pMD18-TVector購自Takara公司，PGL3-basic報(bào)告基因載體購自Promega公司，γ-32pATP購自北京福瑞德公司，雙重?zé)晒馑孛笀?bào)告基因檢測試劑盒購自promega公司，抗體購自Santacruz公司。 2.實(shí)驗(yàn)方法：以CoCl2為低氧的模擬刺激刺激人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SK-N-SH，提取RNA，進(jìn)行Real-timePCR定量分析nNOSmRNA的表

6、達(dá)情況。以熒光染料DAF-ⅡA檢測在刺激后NO產(chǎn)生情況；Western-blot方法分析在刺激后nNOS蛋白的表達(dá)情況。設(shè)計(jì)探針，以同位素標(biāo)記，以EMSA的方法檢測nNOSExon1f啟動子區(qū)域的低氧反應(yīng)元件(HRE)和C/EBPα反應(yīng)元件的活性，并以ChIP的方法驗(yàn)證。構(gòu)建PGL3-basic熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體，在CoCl2的刺激下檢測其報(bào)告基因的表達(dá)，鑒定反應(yīng)元件的活性。以CoCl2為低氧的模擬刺激對人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SK-

7、N-SH進(jìn)行預(yù)適應(yīng)刺激，以無血清模擬低氧刺激，MTT法檢測細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞方法檢測細(xì)胞凋亡。提取RNA，進(jìn)行RT-PCR分析nNOSmRNA和BCL-2，Apaf-1的表達(dá)情況。 結(jié)果:1.CoCl2刺激對SK-N-SH細(xì)胞nNOS基因表達(dá)的影響：Real-timePCR檢測結(jié)果表明在CoCl2刺激下SK-N-SH細(xì)胞中nNOS的表達(dá)升高，并且呈時(shí)間和劑量依賴性。DAF-ⅡA熒光染料分析表明在CoCl2刺激下SK-N-SH細(xì)胞

8、中NO的含量升高，在應(yīng)用了nNOS特異性拮抗劑7-NI后可以使NO的含量下降，表明了在CoCl2刺激下SK-N-SH細(xì)胞中NO的含量升高至少有一部分來源于nNOS.Western-blot結(jié)果表明在CoCl2刺激下SK-N-SH細(xì)胞中nNOS的蛋白表達(dá)增高，而7-NI可以拮抗這種作用。 2.nNOSExon1f啟動子區(qū)域低氧反應(yīng)元件HRE的鑒定：EMSA的結(jié)果顯示nNOSExon1f啟動子區(qū)域的HRE可以和轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α結(jié)

9、合。ChIP結(jié)果表明在CoCl2的刺激下HIF-1α和該HRE的結(jié)合增強(qiáng)。pGL3熒光素酶報(bào)告基因的檢測結(jié)果表明在CoCl2的刺激下含HRE的啟動子活性增加60％。 3.nNOSExon1f啟動子區(qū)域C/EBPα反應(yīng)元件的鑒定：EMSA的結(jié)果顯示nNOSExon1f啟動子區(qū)域的C/EBPα結(jié)合位點(diǎn)可以和轉(zhuǎn)錄因子C/EBPα結(jié)合。ChIP結(jié)果表明在CoCl2的刺激下HIF-1和該C/EBPα反應(yīng)元件的結(jié)合增強(qiáng)。pGL3熒光素酶報(bào)告

10、基因的檢測結(jié)果表明在CoCl2的刺激下含有C/EBP反應(yīng)元件的啟動子活性增加30％。 4.CoCl2對細(xì)胞血清剝奪的保護(hù)作用：CoCl2可以產(chǎn)生保護(hù)作用抵抗無血清的刺激，nNOS在這個(gè)預(yù)適應(yīng)發(fā)揮重要作用，可以調(diào)節(jié)BCL-2，Apaf-1基因的表達(dá)。 結(jié)論證實(shí)了在CoCl2刺激下SK-N-SH細(xì)胞中nNOS表達(dá)在mRNA，蛋白和產(chǎn)物水平都升高。表明在神經(jīng)細(xì)胞的低氧反應(yīng)中nNOS起到重要的作用。本研究首次鑒定了nNOSExo