核因子（NF）-κB乙?；瘜ι窠?jīng)型一氧化氮合酶（nNOS）基因表達(dá)的調(diào)控.pdf

1、本研究以TSA為乙?；饔靡蛩?，探討了乙?；瘜θ松窠?jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH細(xì)胞中nNOS基因表達(dá)的調(diào)控作用，證明了TSA引起的NF-kB乙?；瘜NOS 1f啟動子活性的影響是乙酰化調(diào)節(jié)nNOS表達(dá)的一種機(jī)制，并進(jìn)一步研究了p300在TSA對NF-kB乙?；秸{(diào)節(jié)中的作用。 材料與方法 一、實驗材料 1、人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SK-N-SH2、Real-time RT-PCR及Nuclear run-off實驗相

2、關(guān)試劑3、Western印跡雜交相關(guān)試劑及NO特異性熒光染料DAF-2 DA4、基因克隆及螢光素酶報告基因檢測相關(guān)試劑5、電泳泳動遷移實驗(EMSA)、染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)及免疫沉淀(IP)相關(guān)試劑二、實驗方法1、Real-time RT-PCR方法檢測TSA刺激前后總nNOS及外顯子1f特異性nNOS轉(zhuǎn)錄本mRNA表達(dá)水平的變化；Nuclear run-off方法檢測TSA對nNOS基因轉(zhuǎn)錄效率的影響。 2、Wester

3、n印跡雜交檢測TSA對nNOS蛋白表達(dá)水平的作用；DAF-2 DA熒光染色檢測TSA對nNOS催化的NO合成水平的影響。 3、應(yīng)用軟件分析nNOS lf啟動子結(jié)構(gòu)；并構(gòu)建系列截短的nNOS 1f啟動子螢光素酶報告基因載體，應(yīng)用雙螢光素酶檢測系統(tǒng)分析各段啟動子的活性。 4、EMSA方法體外鑒定nNOS 1f啟動子區(qū)NF-kB反應(yīng)元件及TSA對NF-kB與該元件結(jié)合力的影響；ChIP實驗進(jìn)一步在體內(nèi)條件下驗證NF-kB與該位

4、點的結(jié)合及TSA對這種結(jié)合的作用。 5、應(yīng)用NF-kB p65及p50亞基特異性抗體進(jìn)行免疫沉淀，并應(yīng)用抗乙酰化賴氨酸單克隆抗體為一抗進(jìn)行Western印跡雜交，檢測TSA對p65及p50乙?；降恼{(diào)節(jié)作用。 6、雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)鑒定NF-kB反應(yīng)元件在TSA對nNOS 1f啟動子活性調(diào)節(jié)中的作用。 7、應(yīng)用免疫共沉淀方法，分別采用p65、p50或p300抗體進(jìn)行免疫沉淀，并相應(yīng)使用p300或p65、

5、p50抗體為一抗進(jìn)行Western印跡雜交，檢測p300與NF-kB p65、p50亞基的相互作用及TSA對這種作用的影響；應(yīng)用p300特異性抗體進(jìn)行ChIP實驗，檢測p300與染色質(zhì)NF-kB反應(yīng)元件區(qū)域的結(jié)合及TSA對其的作用；采用Western印跡雜交檢測TSA對p300表達(dá)水平的影響。 8、細(xì)胞轉(zhuǎn)染野生型或HAT結(jié)構(gòu)域缺失的突變型p300表達(dá)載體后，以p300抗體進(jìn)行免疫沉，抗乙酰化賴氨酸抗體為一抗進(jìn)行Western印跡雜交，檢

6、測p300對NF-kB的乙酰化作用及TSA對這種作用的影響。 結(jié)果 1、Real-time RT-PCR結(jié)果證明外顯子1f特異性轉(zhuǎn)錄本為SK-N-SH細(xì)胞中nNOS基因最主要的轉(zhuǎn)錄本，同時TSA以時間及濃度依賴方式上調(diào)總nNOS及外顯子1fnNOS mRNA表達(dá)水平；nuclear run－off實驗證明TSA使nNOS轉(zhuǎn)錄效率提高。 2、Western印跡雜交及DAF-2 DA熒光檢測顯示TSA使SK-N-SH

7、細(xì)胞中nNOS蛋白及nNOS催化的NO合成水平顯著增加。 3、軟件分析發(fā)現(xiàn)nNOS 1f啟動子內(nèi)存在一些潛在的受乙?；揎椀霓D(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點；螢光素酶報告基因檢測在啟動子內(nèi)發(fā)現(xiàn)兩個正調(diào)控區(qū)和兩個負(fù)調(diào)控區(qū)。 4、EMSA實驗在體外條件下證明了nNOS 1f啟動子-893～884區(qū)為NF-kB反應(yīng)元件，并且TSA使NF-kB p65及p50亞基與該位點結(jié)合增強(qiáng)；ChIP實驗進(jìn)一步在體內(nèi)條件下獲得了相同的結(jié)果。 5、免

8、疫沉淀結(jié)合Western印跡雜交在基礎(chǔ)狀態(tài)下觀察到了NF-KB p65及p50亞基的乙?；?，并且TSA可上調(diào)二者乙?；?。 6、應(yīng)用螢光素酶報告基因系統(tǒng)證明了本實驗所鑒定的NF-kB反應(yīng)元件是nNOS 1f啟動子中一個強(qiáng)大的正調(diào)控元件，同時它在TSA引起的nNOS 1f啟動子的轉(zhuǎn)錄激活中發(fā)揮重要作用。 7、免疫共沉淀結(jié)果顯示細(xì)胞核中p300與NF-kB p65及p50亞基之間存在相互作用，TSA可加強(qiáng)二者間的作用；Ch

9、IP結(jié)果提示p300參與結(jié)合nNOS 1f啟動子NF-kB反應(yīng)元件，TSA可募集p300至該區(qū)域；Western印跡雜交顯示TSA能夠上調(diào)p300蛋白表達(dá)水平。 8、免疫沉淀結(jié)合Western印跡雜交顯示p300能夠直接乙?；疦F-kB p65及p50亞基，并且TSA使p300的作用增強(qiáng)。 結(jié)論 1、nNOS 1f啟動子-893～884區(qū)為NF-kB反應(yīng)元件。 2、TSA通過增強(qiáng)p300與NF-kB p6