肝癌患者來源的移植瘤模型構(gòu)建、特征描述及基于此模型的索拉菲尼耐藥標(biāo)志物研究.pdf

1、目的：
　　雖然近幾年外科及其他治療手段的不斷進(jìn)步，但是肝癌患者總體生存率依舊不理想，原因在于肝癌患者發(fā)病隱匿，早期診斷困難，多數(shù)患者在確診時(shí)已為晚期，失去手術(shù)機(jī)會;即使行手術(shù)治療，術(shù)后仍有較高的復(fù)發(fā)率，且復(fù)發(fā)后缺乏有效治療手段。因此，尋找對晚期肝癌和復(fù)發(fā)性肝癌切實(shí)有效的治療方法，對延長肝癌患者生存有重要意義。
　　分子靶向藥在腫瘤治療中的應(yīng)用越來越多，索拉菲尼也被證實(shí)在肝癌中有效，提示分子靶向藥物可能是治療肝癌的新方法。但

2、是目前進(jìn)入肝癌臨床試驗(yàn)的靶向藥物中，除了索拉菲尼以外，其余全部被證實(shí)在總體人群中無效。即使是索拉菲尼，在臨床應(yīng)用中同樣有約50％的患者無效，但是我們無法在用藥之前判斷索拉菲尼的療效。因此，肝癌缺乏有效的分子靶向藥物和用來指導(dǎo)靶向藥物治療的生物標(biāo)志物或者分子分型。
　　患者來源的移植瘤模型(Patient-derived xenograft models，PDXs)是目前被認(rèn)為最接近臨床患者的藥物篩選模型。PDX模型保持了所來源腫瘤

3、的生物學(xué)特征，并且PDX對藥物的療效評價(jià)與藥物臨床實(shí)際效果較為一致，逐漸地被應(yīng)用于藥物研發(fā)、敏感標(biāo)志物篩選等研究中。但是肝癌PDX模型和其對臨床患者腫瘤的代表性報(bào)道相對較少，其應(yīng)用價(jià)值值得探討。
　　索拉菲尼作為唯一應(yīng)用于肝癌臨床治療的藥物，在整體人群中僅有約50％患者有效，而另一半患者則對索拉菲尼不敏感，使得索拉菲尼的整體療效欠佳，并使得一半患者承受藥物不良反應(yīng)帶來的痛苦和巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。而在索拉菲尼耐藥研究中，受限于體內(nèi)外腫瘤

4、模型的限制，如體外模型多，體內(nèi)模型少，模式動物多，人源化的模型少，使得索拉菲尼耐藥機(jī)制和標(biāo)志物仍不清楚，亟待進(jìn)一步研究。
　　方法:
　　本研究首先通過新鮮腫瘤組織移植方法構(gòu)建了大規(guī)模的肝癌PDX模型隊(duì)列，并對比PDX模型與對應(yīng)來源腫瘤組織的生物學(xué)特征，通過全外顯子組測序、SNP芯片、表達(dá)譜芯片等技術(shù)，描繪了PDX模型的分子遺傳學(xué)特征，并與現(xiàn)有肝癌測序數(shù)據(jù)對比，來研究PDX模型與來源患者腫瘤組織的生物學(xué)一致性。同時(shí)對建模成功

5、與未建成功患者的臨床資料進(jìn)行對比分析，分析建模過程本身的應(yīng)用價(jià)值。并且根據(jù)PDX模型遺傳學(xué)特征進(jìn)行可能用于肝癌治療的靶向藥物整理和初步篩選。通過聯(lián)合模型對索拉菲尼的敏感性與表達(dá)譜數(shù)據(jù)，尋找與索拉菲尼藥物敏感性相關(guān)的生物標(biāo)志物，并通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
　　結(jié)果:
　　本研究共建成肝細(xì)胞癌PDX模型242例、肝內(nèi)膽管癌PDX模型71例，建模成功率分別為30.2％和33.8％，平均建成時(shí)間為90(65，130)天和110(80，1

6、50)天。PDX建模成功所需的時(shí)間短于相應(yīng)患者的無瘤生存期。
　　PDX模型保持了所來源腫瘤組織的病理學(xué)特點(diǎn)，并且在腫瘤標(biāo)志物甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)的表達(dá)上與患者一致。建模成功在肝細(xì)胞癌患者中與患者年齡＜50、HBeAg陽性、腫瘤直徑＞5cm、AFP＞20U/L、Edmondson GradeⅢⅣ級、微血管侵犯、大血管侵犯、子灶、包膜不完整、早期復(fù)發(fā)等惡性表型相關(guān)，并且預(yù)示患者較差的無瘤生存期及總體

7、生存期。同樣建模成功在肝內(nèi)膽管癌中與CA19-9＞39U/L、早期復(fù)發(fā)等指標(biāo)相關(guān)，也預(yù)示肝內(nèi)膽管癌較差的臨床預(yù)后。
　　肝癌患者常見的基因突變中，除少數(shù)基因的變異未在PDX模型中檢測出，絕大多數(shù)均可在PDX模型中找到。在PDX模型中肝癌常見突變基因的突變率分別為TP53(67.62％)、TP53(67.6％)、TTN(93.3％)、CTNNB1(11.4％)、JAK1(6.7％)等;常見拷貝數(shù)擴(kuò)增ARNT(20.5％)、MTDH(

8、16.2％)、CCND1(12.4％)、FGF19(11.4％)和MET(16.1％)等;拷貝數(shù)缺失RB1(11.4％)、SMAD4(18.1％)、WRN(15.2％)、ARID1A(7.6％)、CDKN2A(12.4％)和PTEN(5.7％)等。
　　索拉菲尼在PDX模型中的有效率約為40％，與臨床試驗(yàn)的結(jié)果相符。對索拉菲尼耐藥的PDX模型中細(xì)胞周期、WNT信號通路、IFNa/b信號通路異常，聯(lián)合應(yīng)用細(xì)胞周期的抑制劑LEE011

9、及IFNa均可提高索拉菲尼抗腫瘤效果。DKK1在耐藥組中高表達(dá)，并且在體外誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞系中高表達(dá)，同時(shí)在PDX模型中與腫瘤較差的無進(jìn)展生存期相關(guān)，且在連續(xù)用藥過程中上調(diào)。干擾DKK1后可影響細(xì)胞對索拉菲尼的敏感性。臨床上，用藥一年內(nèi)死亡的患者血清DKK1水平高于用藥一年以上的患者。
　　結(jié)論:
　　1.肝癌PDX模型保持了患者腫瘤組織的生物學(xué)特點(diǎn)，肝癌常見的基因突變均可在PDX模型隊(duì)列中找到對應(yīng)模型，PDX模型建成時(shí)間早于腫