生物催化合成UMP及乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶特性的研究.pdf

1、核苷酸是一類(lèi)在代謝上極為重要的生化物質(zhì)，除了作為DNA、RNA的前體外，在細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝、能量的儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)化、免疫反應(yīng)，及信號(hào)傳導(dǎo)中，都有核苷酸的參與。嘧啶核苷酸的用途廣闊，在食品制造、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥生產(chǎn)上都有極為重要的用途。近年來(lái)隨著核酸工業(yè)的發(fā)展，其作為藥物中間體、保健品和食品添加劑的重要性越來(lái)越突出。此外，它還是寡聚糖合成中的必需前體，而后者因其在生化識(shí)別過(guò)程中的重要作用成為眾多研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。尿嘧啶核苷酸(UMP)是嘧啶核苷酸生物合成

2、中處于結(jié)點(diǎn)位置的重要核苷酸。在寡聚糖合成和抗癌藥物生產(chǎn)中，UMP都是重要的前體物質(zhì)。其市場(chǎng)需求很大，蘊(yùn)含有良好的商業(yè)潛力。但與此同時(shí)，由于生產(chǎn)困難，嘧啶核苷酸價(jià)格昂貴已成為該領(lǐng)域進(jìn)一步發(fā)展的主要限制因素。特別是在我國(guó)，嘧啶核苷酸產(chǎn)品缺乏限制了糖化學(xué)和糖生物學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的研究。 微生物轉(zhuǎn)化合成核苷酸，就是利用微生物作為酶源，催化核苷酸的前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為核苷酸。相對(duì)于其他生產(chǎn)方法，該方法不但縮短了生產(chǎn)周期，也使核苷酸的產(chǎn)量大大增加；反應(yīng)

3、體系簡(jiǎn)單，后提取工藝相對(duì)更簡(jiǎn)單容易；而且，該方法可以通過(guò)偶聯(lián)不同的基因工程菌株，生產(chǎn)多種復(fù)雜核苷酸、核苷糖乃至寡聚糖。這在核苷酸工業(yè)、醫(yī)藥及糖化學(xué)、糖生物學(xué)合成工業(yè)中是極其重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，也是其他方法不能替代的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本工作以UMP為模式核苷酸探討了微生物催化合成核苷酸過(guò)程中的主要影響因素，分別從轉(zhuǎn)化條件和菌株(催化關(guān)鍵酶)的角度對(duì)核苷酸催化合成過(guò)程進(jìn)行了詳細(xì)的描述。 首先根據(jù)核苷酸類(lèi)物質(zhì)的電荷及結(jié)構(gòu)差異，分別建立了薄板層

4、析和高壓液相色譜(HPLC)的檢測(cè)方法來(lái)分離檢測(cè)核苷酸類(lèi)物質(zhì)。其中，薄板層析檢測(cè)法可以分離乳清酸和UMP，定性分析轉(zhuǎn)化液中的底物和產(chǎn)物；而建立在離子對(duì)色譜技術(shù)基礎(chǔ)上的HPLC檢測(cè)方法可以同時(shí)分離多種核苷酸類(lèi)物質(zhì)，并可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)反應(yīng)中的產(chǎn)物定量，從而為后面的工作奠定了基礎(chǔ)。 在建立了快捷的檢測(cè)方法后，采用產(chǎn)氨棒桿菌模式菌株Cornebacteriumammoniagenes ATCC6872，以乳清酸為底物，建立了微生物催化合

5、成LiMP的方法。整個(gè)過(guò)程分兩步進(jìn)行：首先將C ammoniagenes ATCC6872在高鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)；在菌體細(xì)胞達(dá)到最高轉(zhuǎn)化能力時(shí)收集細(xì)胞，作為催化反應(yīng)體系的酶源。首先考察了培養(yǎng)條件對(duì)UMP生產(chǎn)的影響，在以玉米漿作氮源，pH7.0的培養(yǎng)基中培養(yǎng)15小時(shí)(處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期)的菌體顯示出最高的轉(zhuǎn)化能力，在相同的反應(yīng)條件下能生產(chǎn)更多的UMP。確定了培養(yǎng)條件以后，分別通過(guò)單因子實(shí)驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)催化反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。通過(guò)單因子實(shí)驗(yàn)，確

6、定了催化反應(yīng)液的最優(yōu)組成為乳清酸，葡萄糖，磷酸離子(等摩爾的KH<,2>PO<,4>和K<,2>HPO<,4>)，MgCl<,2>和Triton X-100。而統(tǒng)計(jì)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確了催化反應(yīng)體系中最主要的影響因素：磷酸離子和作為酶原的C ammoniagenes細(xì)胞。在此基礎(chǔ)上，最后通過(guò)中心組合實(shí)驗(yàn)得到最優(yōu)的反應(yīng)物配比，使UMP的產(chǎn)量達(dá)到32 mM(10.4 g 1<'-1>)，是優(yōu)化前產(chǎn)量的3倍以

7、上。乳清酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(OPRTase)催化乳清酸和5.磷酸核糖焦磷酸(PRPP)合成乳清苷酸，是嘧啶核苷酸合成中形成核苷酸的一步，也是生物催化法合成UMP的關(guān)鍵酶。利用巢式PCR和原位雜交的方法得到了C. ammoniagenesATCC6872中的一個(gè)623bp的DNA片斷(p26)。序列分析顯示該片斷包含了555bp的編碼OPRTase的基因pyrE和63 bp的前導(dǎo)區(qū)。和已詳細(xì)研究的Escherichiacoli和Salmon

8、ella typhimurium的OPRTase相比，其編碼區(qū)編碼的氨基酸序列的相似性只有28％。序列分析顯示，OPRTase的大多數(shù)活性區(qū)和活性位點(diǎn)在克隆到的酶中都能找到，也有一些在S,typhimurium OPRTase中被認(rèn)為是活性必需的位點(diǎn)在C. ammoniagenes的酶中被具有相似側(cè)鏈或相似極性的其它氨基酸所代替。這些氨基酸被認(rèn)為在催化中的作用并不會(huì)因此產(chǎn)生重大改變。但值得注意的是，S.typhimurium的OPRTa

9、se上的一個(gè)重要的活性位點(diǎn)，Lys 73，在C. ammoniagenes的OPRTase中卻找不到。據(jù)報(bào)道，該位點(diǎn)和OPRTase的催化起始有關(guān)。該位點(diǎn)的缺失暗示C. ammoniagenes的OPRTase和之前報(bào)道的其它物種的OPRTase可能在性質(zhì)和催化機(jī)理上有很大差異。因此，構(gòu)建了pyrE基因的表達(dá)質(zhì)粒，使該基因在E coli中過(guò)量表達(dá)，并純化了在E coli中過(guò)量表達(dá)的C ammoniagenes ATCC6872的OPRT

10、ase。 該酶和多數(shù)OPRTase一樣，屬于同源二聚體；催化的反應(yīng)需要有二價(jià)金屬離子的激活，Mg<'2+>是反應(yīng)最適激活劑，其最適濃度為1-3 mM，Mn<'2+>和Co<'2+>也可以活化反應(yīng)，而其他金屬離子(Zn<'2+>，Ca<'2+>，Ba<'2+>，Ni<'2+>)都不能替代鎂離子起到活化反應(yīng)的作用；該OPRTase不耐熱，50℃保溫30 min就會(huì)造成50％的酶活損失，而最適反應(yīng)溫度出現(xiàn)在35℃；該酶催化的正反應(yīng)(O

11、MP合成反應(yīng))和逆反應(yīng)(OMP焦磷酸解反應(yīng))的最適pH不同，正反應(yīng)的最適pH為10.5-11.5，而逆反應(yīng)的為5.5；對(duì)該酶催化的正逆反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)也進(jìn)行了研究，通過(guò)雙倒數(shù)曲線(xiàn)得到乳清酸、PRPP、OMP和PPi的K<,m>值分別為33¨M，64 1.tM，45“M，和36μM。正反應(yīng)的最大反應(yīng)初速度(V<,max>)為1，150 units mg<'-1>蛋白，逆反應(yīng)的最大反應(yīng)初速度(V<,max>)為550 unitsmg<'-1

12、>蛋白。和其他已報(bào)道的OPRTase相比，C. ammoniagenes OPRTase的生化性質(zhì)有幾處明顯的不同：(1)正逆反應(yīng)pH不同。大多數(shù)OPRTase只檢測(cè)了正反應(yīng)的最適pH。(2)正反應(yīng)最適pH偏高。已報(bào)道的OPRTase正反應(yīng)最適pH一般在8-10，而C. ammoniagenes的OPRTase催化正反應(yīng)的最適pH達(dá)到10.5-11.5；(3)OMP的K<,m>值偏高。比其他OPRTase報(bào)道的K<,m>值高了將近10倍

13、。這些性質(zhì)上的差異都指向一個(gè)催化上重要位點(diǎn)的缺失，Lys 73。該位點(diǎn)的缺失也暗示著C ammoniagenes OPRTase的催化機(jī)理可能不同于以往的報(bào)道。 嘧啶合成基因的表達(dá)調(diào)控在多種生物中都有報(bào)道，本文也考察了Cammoniagenes ATCC6872中編碼OPRTase的pyrE基因的表達(dá)調(diào)控情況。對(duì)培養(yǎng)在含有尿嘧啶和不含有尿嘧啶的培養(yǎng)基中的原始菌株的OPRTase酶活的測(cè)定顯示，尿嘧啶會(huì)抑制C ammoniagen

14、es ATCC6872 pyrE基因的表達(dá)。隨后，帶有63bp非編碼前導(dǎo)序列的pyrE基因(p26)被克隆到一個(gè)表達(dá)載體上，并轉(zhuǎn)化到E coli宿主中。在E coli中的實(shí)驗(yàn)證明p26對(duì)尿嘧啶敏感：培養(yǎng)在含有尿嘧啶的培養(yǎng)基中的p26轉(zhuǎn)化子的OPRTase活力比不含尿嘧啶的培養(yǎng)基中低，而作為對(duì)照組的不含63 bp前導(dǎo)區(qū)的pyrE基因，在這兩種培養(yǎng)基中顯示了相差無(wú)幾的活力。這說(shuō)明在63 bp的前導(dǎo)區(qū)內(nèi)包含了一個(gè)對(duì)尿嘧啶敏感的調(diào)控因子。

15、 最常見(jiàn)的嘧啶合成基因的調(diào)控元件是衰減子。但是對(duì)p26的前導(dǎo)區(qū)的序列分析卻顯示在這63 bp前導(dǎo)區(qū)內(nèi)，沒(méi)有任何可能的衰減子結(jié)構(gòu)。而隨后在棒桿菌內(nèi)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，在C ammoniagenes中這63 bp的前導(dǎo)區(qū)沒(méi)有調(diào)控功能：含有p26的C ammoniagenes轉(zhuǎn)化子在尿嘧啶存在下表現(xiàn)出的OPRTase活力和不存在尿嘧啶時(shí)相差不大。這樣的結(jié)果意味著63 bp的前導(dǎo)區(qū)中包含的調(diào)控因子只在E coli中起作用，而在棒桿菌中不起作用。

16、由于E coli中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有多種調(diào)控機(jī)制可以控制pyr基因的表達(dá)，那么，最有可能的情況或許是這63 bp中包含的Ecoli的某一種調(diào)控機(jī)制在棒桿菌中是不存在的。C ammoniagenes是生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)嘧啶核苷酸的工業(yè)菌株，它提供了合成LIMP的酶源和一個(gè)重要底物PRPP，是UMP合成的關(guān)鍵。OPRTase催化UMP催化合成中的第一步反應(yīng)，它的表達(dá)受到體內(nèi)核苷酸的反饋抑制。當(dāng)UMP濃度過(guò)高時(shí)，會(huì)抑制該酶的表達(dá)，限制了UMP的產(chǎn)量。為了

17、提高UMP產(chǎn)量，我們克隆了C.ammoniagenes ATCC6872的一個(gè)組成型啟動(dòng)子，IJ59，并將它與p26連接，構(gòu)建了無(wú)需誘導(dǎo)即可過(guò)量表達(dá)合成中關(guān)鍵酶(OPRTase)的穿梭質(zhì)粒pXMJIE。在E coli中的實(shí)驗(yàn)表明該質(zhì)粒在非誘導(dǎo)狀態(tài)下培養(yǎng)12小時(shí)，其OPRTase活力能達(dá)到對(duì)照菌株的5倍以上。雖然由于研究時(shí)間有限，該表達(dá)質(zhì)粒在C.ammoniagenes中表達(dá)的實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)在還在進(jìn)行當(dāng)中，但根據(jù)Paik和Lee的報(bào)道，IJ59