藤梨根提取物抗膽管癌作用的體內外實驗研究.pdf

1、目的:
　　膽管癌是起源于膽管上皮細胞的惡性腫瘤。近年來，其發(fā)病率在全球范圍內呈上升趨勢。其惡性程度高，發(fā)病隱匿，大多數患者在確診時已喪失手術機會，且該病對放、化療不敏感。因此臨床迫切需要探討對膽管癌更為有效的治療方法。藤梨根具有清熱解毒、消腫疥、祛風濕的功效。是臨床上常用于抗腫瘤治療的中草藥，尤其對消化道腫瘤療效較佳。近年體內外實驗研究發(fā)現，藤梨根制劑對多種腫瘤有抑制作用，可通過多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用，其藥理研究和臨床驗證受到廣

2、泛關注。有關藤梨根提取物(Radix Actinidia Extractive，RAE)對膽管癌的作用尚未見報道。
　　本研究以人膽管癌細胞株QBC939細胞作為研究對象，采用MTS法、流式細胞術、形態(tài)學觀察、Western blot及裸鼠移植瘤生長抑制作用實驗等方法，觀察RAE對人膽管癌細胞的生長抑制作用和凋亡誘導作用以及凋亡相關蛋白的表達情況，并觀察RAE對QBC939細胞裸鼠移植瘤的生長抑制作用。
　　材料和方法:

3、r>　　體外培養(yǎng)人膽管癌QBC939細胞，取對數生長期細胞用于實驗。將RAE用DMEM培養(yǎng)基稀釋成低濃度組(1.25mg/ml)，中濃度組(2.5mg/ml)和高濃度組(5mg/ml)。采用MTS法檢測不同濃度的RAE對QBC939細胞存活率的影響，及高濃度組RAE作用于QBC939細胞12h，24h，36h及48h對細胞存活率的影響;采用流式細胞術檢測不同濃度組RAE對QBC939細胞的凋亡誘導作用;采用普通光學顯微鏡觀察RAE處理前

4、后細胞的形態(tài)學變化;采用Hoechst33342染色法觀察RAE處理前后細胞核的染色情況;采用Western blot法檢測RAE作用前后QBC939細胞Caspase-8，Caspase-3，cleaved-PARP，Survivin和Mcl-1蛋白的表達。建立人膽管癌QBC939細胞裸鼠皮下移植瘤模型，成瘤后隨機分為對照組和實驗組，分別每天腹腔注射生理鹽水和RAE溶液，2周后比較終術腫瘤體積。
　　結果:
　　1、MTS

5、實驗:RAE處理后的細胞存活率明顯低于對照組。細胞存活率在研究范圍內與藥物作用濃度及作用時間成負相關。
　　2、流式細胞實驗:RAE處理后的細胞凋亡比例高于對照組。細胞凋亡比例在研究范圍內與藥物作用濃度成正相關。
　　3、形態(tài)學觀察:隨著RAE濃度增加及作用時間延長，QBC939細胞的細胞間隙增大，細胞胞漿中顆粒增多，細胞空泡化、脫壁，細胞周圍碎片增多。Hoechst33342熒光染色觀察到RAE處理組細胞核呈現塊狀、濃染熒

6、光。
　　4、Western blot實驗:與對照組相比，各個濃度RAE處理組的QBC939細胞活化型Caspase-8及Caspase-3蛋白表達升高，切割的PARP蛋白表達升高。Survivin及Mcl-1蛋白表達下降。
　　5、裸鼠移植瘤生長抑制作用實驗:RAE處理組的裸鼠移植瘤終末腫瘤體積明顯小于對照組。
　　結論:
　　RAE顯著抑制QBC939細胞生長，其細胞生長抑制率與RAE濃度及作用時間呈正相關。