Mormyrid電感受葉顆粒細胞對傳入纖維動作電位的調控和電突觸在電魚腦內分布的研究.pdf

1、來自南美洲和非洲的一種淡水電魚Mormyrid，有著非常發(fā)達的小腦和小腦樣結構。 本課題采用可視情況下的腦片全細胞膜片鉗技術、注射生物素(biocytin)、神經生物素(neurobicytin)標記細胞、以及染色耦合(dye Cpupling)技術，并通過建立傳入纖維和顆粒細胞之間的電突觸聯(lián)系的計算機模型，對電魚電感受葉顆粒細胞的形態(tài)特征、電生理特性、和突觸反應，進行了較詳細的觀察，以揭示顆粒細胞在電感受傳入通路中對外周信息

2、的解碼機制，及其在整合傳入信號過程中進行精確時間編碼(temporal coding)和重合檢測時所起的作用。同時，實驗還利用特異性標記神經系統(tǒng)電突觸連接子Connexin-36的抗體，用免疫細胞化學和Westerrl blot等技術，分析電魚Mormyrid腦內構成電突觸的連接體(connexon)的分子組成和電突觸的分布情況；并用一些束路追蹤(tract tracing)手段，對mormirid電感受葉中的神經環(huán)路組成作了進一步闡明

3、。 第一部分：電感受葉顆粒細胞對電感受傳入纖維動作電位的發(fā)生和幅度調控的腦片膜片鉗研究 實驗結果顯示： 1.細胞內或細胞外注射Biocytin進行細胞標記后均可見，表層顆粒細胞胞體直徑約3～5μm，有主富的底樹突，軸突可投射至神經節(jié)細胞層(ganglion layer)或分子層底層；深層顆粒細胞胞體直徑約5～7μm，只有少量的底樹突，其軸突僅投射至網(wǎng)狀層(plexiform layer)或神經節(jié)細胞層基底部

4、，深層顆粒細胞軸突起始部位較細，離開胞體10～20Fm后突然加粗，末端呈爪樣分布；放置在切斷的神經斷端的Neurobiotin進入到傳入神經纖維后，可見表層顆粒細胞出現(xiàn)大量反映縫隙連接的染色耦合，而深層顆粒細胞只有少數(shù)有耦合標記。 2.用單一電刺激興奮傳入神經纖維，可以在表層和深層顆粒細胞記錄到“全或無”式的EPSP。 3.eEPSP的幅度可隨著突觸后細胞本身膜電位的改變而改變。 4.隨著刺激電極放置位置的

5、改變，同一顆粒細胞上除了可以記錄到“全或無”式的eEPSP外，尚可記錄到“全或無”式的IPSP、或者兩種電位的復合，表明顆粒細胞有可能分別接受興奮性、抑制性傳入纖維，或同時接受兩種不同類型的傳入纖維。 以上結果表明： (1)Mormyrid小腦電感受葉表層和深層的顆粒細胞在結構和功能特性上是完全不同的兩類細胞，不僅有胞體分布位置、細胞形態(tài)、軸突投射部位的不同，Neurobiotin染色耦合的特點也不同。 (2)表層和深層的顆粒

6、細胞均可記錄到eEPSP，并且根據(jù)染色耦合的實驗結果，結合以前的電鏡觀察，表明傳入纖維和顆粒細胞之間存在有電突觸。 (3)特別值得提出的是，表層和深層顆粒細胞均可由于自身膜電位的改變，通過電突觸，對突觸前末梢傳入進行調控；它是一種尚未報道過的突觸傳遞的調控形式，有特殊的功能意義。(4)Mormyrid小腦電感受葉的同一顆粒細胞可以分別或同時接受興奮性或抑制性的傳入纖維，從而產生eEPSP或IPSP。 第二部分：顆粒細胞膜電位對

7、EPSP幅度調節(jié)的計算機建模研究 在體電生理實驗表明，Mormyrid的電感受傳入纖維通過其動作電位的數(shù)目、尤其是通過動作電位的潛伏期來編碼外周信號刺激強度，傳入纖維可以通過非常精確的時間分辨來反映周圍環(huán)境的改變。那么，與感覺傳入纖維形成電突觸聯(lián)系的顆粒細胞又是通過何種機制將外周信息精確地傳入高級中樞?在第一部分腦片膜片鉗實驗中，我們已經證實了突觸后顆粒細胞自身膜電位變化對突觸前傳入一末梢動作電位的發(fā)生和幅度具有精確的調控。為

8、了進一步檢驗上述的實驗結果和我們對實驗結果提出的假設，本實驗利用電生理學記錄的資料和數(shù)據(jù)，使用適當?shù)膮?shù)，并運用計算機技術，建立了以電突觸為聯(lián)系方式的電感受器傳入纖維一顆粒細胞的計算機房室模型(compartmental Model)。 第三部分：電魚Mormyrid腦內縫隙連接的分布： 本實驗以Cx36和Cx45的多克隆抗體，運用免疫組織化學、westem blot，結合biotinylated-dextran a

9、mine(BDA)順行和逆行追蹤標記、雙標染法、和激光共聚焦顯微鏡成像技術等實驗手段，對縫隙連接連接子蛋白Cx36和Cx45在電魚腦內的分布情況進行了研究，旨在分析縫隙連接的連接子蛋白(每6個連接子蛋白單體組成一個六聚體的水相通道，稱為connexon，即連接體)和連接體的結構和組成，以便對電感受信號的傳入通路及命令信號的傳出通路做進一步的理解，進一步分析它們可能對電感受信號的傳導通路作出的影響。 實驗結果表明： 1

10、.Western blot實驗結果顯示，在Mormyrid腦組織中，Cx36抗體可檢測到分子量為35kD和70kD的蛋白肽段，Cx45抗體卻未能顯示出分子量為45KD的蛋白肽段。然而在大鼠腦組織中，Cx45抗體能特異性地檢測到分子量為45kD蛋白肽段。這表明，Mormyrid腦內的縫隙連接可能不存在連接子蛋白Cx45。 2.使用Cx36抗體，我們成功地標記了以往公認的存在有縫隙連接的部位，如電感受葉的深層顆粒細胞、電感受葉神經

11、核(nELL)、半規(guī)隆凸外側核(ELa)、命令神經核(CN)、延髓中繼核(MRN)、以及Maunthner細胞等。 3.使用生物素化右旋糖胺(BDA)逆行標記法，發(fā)現(xiàn)了以前未曾報道過的一些存在縫隙連結的區(qū)域，如前命令核(PCN)、腹背側核(VPN)、隆起前核(PE)、網(wǎng)狀-脊髓神經元以及次級聽神經核等。 4.使用BDA順行標記法，成功地顯示了命令神經元所在核CN的傳導通路和它的側支通路(corollary pathw

12、ay)，側支通路包括延髓命令相關核(BCA)、中腦命令神經元(MCA)、旁葉核(JLNm)、旁三叉神經命令相關核(PCA)等。然而，令人感興趣的是，與側支通路有關的這些部位的Cx36抗體標記均呈現(xiàn)陰性結果。 5.電感受葉表層顆粒細胞的Cx36抗體標記也呈現(xiàn)陰性結果。 小結：在本研究中發(fā)現(xiàn)，突觸后顆粒細胞可以通過改變其自身膜電位，通過電突觸，對傳入神經纖維上的動作電位的產生與否和幅度大小進行調節(jié)，從而對突觸后電位的進行

13、精細調節(jié)：同時，傳入纖維和顆粒細胞具有的多突觸聯(lián)系方式和表現(xiàn)出的非線性相加現(xiàn)象，證實了顆粒細胞在感覺信息傳導通路中發(fā)揮著重要的整合作用，為顆粒細胞所具有的高時間分辨率和精確傳遞外界信息的功能，提供了理論依據(jù)；模型實驗研究成功地再現(xiàn)了電生理實驗的研究結果，為下一步進行更深入的顆粒細胞模型研究，也為深入研究電感受葉顆粒細胞對外周及中樞傳入信息的精確整合機制提供了一個可靠平臺；免疫細胞化學標記電魚腦內電突觸組成的實驗結果，既發(fā)現(xiàn)了新的縫隙連接