基于雙室培養(yǎng)系統(tǒng)構建含天然鈣化層仿生組織工程骨軟骨.pdf

1、本文從以下幾部分進行論述：
　　第一部分 含天然鈣化軟骨層仿生組織工程骨軟骨支架的制備及檢測
　　目的：
　　本部分研究中，我們鉆取正常豬膝關節(jié)股骨髁負重面骨軟骨柱，削去骨柱透明軟骨部分。切下的透明軟骨用于Ⅱ型膠原蛋白提取，而含鈣化軟骨層的軟骨下骨柱行脫細胞處理。然后將提取的Ⅱ型膠原蛋白水凝膠接種于鈣化層之上，經(jīng)過凍干及交聯(lián)等步驟，獲得含天然鈣化層的仿生骨軟骨支架，并對支架相關特性進行檢測。
　　方法：
　

2、　1.含天然鈣化軟骨層骨柱的制備及檢測
　　(1)鉆取直徑為12 mm的含有天然鈣化軟骨層結構的骨柱，削去透明軟骨層;
　　(2)Triton X-100脫去骨柱中的細胞;
　　(3)HE染色及DAPI染色觀察骨柱中細胞是否洗脫干凈。
　　2.Ⅱ型膠原蛋白水凝膠的制備
　　(1)獲取透明軟骨粉;
　　(2)胃蛋白酶消化，鹽析及透析。
　　3.骨軟骨支架的制備及檢測
　　(1)三維打印構建骨

3、軟骨支架制備模具;
　　(2)通過模具在脫細胞骨支架上灌注Ⅱ型膠原蛋白水凝膠，再通過凍干、交聯(lián)等步驟制備骨軟骨支架;
　　(3)檢測支架孔隙率、孔徑、細胞毒性及結構特征。
　　結果：
　　構建的骨軟骨支架呈深藍色，細胞洗脫徹底，Ⅱ型膠原蛋白海綿支架平均孔隙率為(96.1±3.8)％，掃描電鏡下測其孔徑平均大小為(102.3±35.3)μm，脫細胞軟骨下骨支架的平均孔隙率為(73.5±2.6)％，其平均孔徑大小為(

4、470.2±158.8)μm，呈多孔網(wǎng)狀結構，孔隙結構良好，孔孔相通。支架浸提液對細胞生長無明顯影響。
　　第二部分 含天然鈣化軟骨層仿生支架雙室培養(yǎng)系統(tǒng)的構建
　　目的：
　　本部分研究中，為了給軟骨層及軟骨下骨層提供獨立的培養(yǎng)微環(huán)境，我們設計了基于鈣化軟骨層的雙室培養(yǎng)系統(tǒng)，利用鈣化軟骨層的隔離帶作用，為軟骨腔及軟骨下骨腔分別提供成軟骨及成骨培養(yǎng)基。在成軟骨及成骨的環(huán)境中，誘導間充質干細胞分別向軟骨細胞及成骨細胞的方

5、向分化。這種雙室培養(yǎng)系統(tǒng)更加符合骨軟骨組織的生理特征，因此可能構建出更加仿生的骨軟骨缺損修復材料。
　　方法：
　　1.雙室培養(yǎng)裝置的構建
　　(1)運用計算機輔助設計技術設計雙室培養(yǎng)系統(tǒng)的計算機三維模型;
　　(2)運用三維打印技術制備雙室培養(yǎng)系統(tǒng)各部件;
　　(3)組裝雙室培養(yǎng)系統(tǒng)，并進行密閉性測試，Co60輻照滅菌。
　　2.人羊膜間充質干細胞培養(yǎng)
　　Ⅰ型膠原酶消化法獲取人羊膜間充質干細

6、胞，差速消化法進行純化。
　　3.人羊膜間充質干細胞復合支架共培養(yǎng)
　　(1)CFDA SE及DiI標記人羊膜間充質干細胞;
　　(2)細胞懸液接種法及凝膠接種法接種CFDA SE標記的細胞于膠原層，DiI標記的細胞于軟骨下骨層，并進行雙室培養(yǎng);
　　(3)通過病理切片、熒光定量PCR、支架總DNA含量檢測等手段，檢測支架中細胞粘附、生長、增殖、分布及分化情況。
　　結果：
　　雙室培養(yǎng)7天后，熒光顯

7、微鏡下可觀察到膠原層CFDA SE標記的綠色熒光細胞，軟骨下骨層DiI標記的紅色熒光細胞，綠色熒光細胞與紅色熒光細胞分別位于鈣化軟骨層兩邊，無跨鈣化層細胞遷移現(xiàn)象。熒光定量PCR檢測膠原層內(nèi)種子細胞的成軟骨標志物隨培養(yǎng)時間延長而逐漸增加，軟骨下骨層內(nèi)種子細胞的成骨標志物隨培養(yǎng)時間延長而逐漸增加。支架中種子細胞總DNA含量隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸增加，因此表明隨著雙室培養(yǎng)時間的延長，支架內(nèi)種子細胞的數(shù)量逐漸增加。
　　第三部分 骨軟

8、骨支架動物實驗
　　目的：
　　在前面的研究基礎上，為了進一步驗證該含天然鈣化層仿生骨軟骨支架對關節(jié)骨軟骨損傷的修復效果。在本部分研究中我們選擇貴州小香豬為實驗動物，通過手術方法行膝關節(jié)股骨髁負重面骨軟骨缺損造模。植入經(jīng)雙室培養(yǎng)的含天然鈣化層的仿生骨軟骨支架，觀察其修復效果，并與空白對照及無天然鈣化層仿生骨軟骨支架的修復效果進行對比。
　　方法：
　　1.含天然鈣化層仿生骨軟骨支架雙室培養(yǎng)
　　(1)Per

9、coll密度梯度離心法獲取豬BMSCs;
　　(2)復合支架進行雙室培養(yǎng)。
　　2.骨軟骨缺損造模及修復
　　(1)30頭貴州小香豬隨機分為3組，每組20膝，共60膝;
　　(2)造模，A組為空白對照組（單純骨軟骨缺損）;B組為不含鈣化層骨軟骨支架修復組;C組為含天然鈣化軟骨層骨軟骨支架修復組;
　　3.修復效果評估
　　體視顯微鏡觀察，核磁共振檢查，HE染色，固綠—番紅O染色，天狼星紅染色及O'Dr

10、iscoll組織學評分評估骨軟骨缺損修復效果。
　　結果：
　　與空白對照及不含鈣化層骨軟骨支架相比，含天然鈣化軟骨層骨軟骨支架在修復骨軟骨缺損中具有良好的修復效果。含天然鈣化軟骨層骨軟骨支架修復組中軟骨下骨層修復組織與宿主組織無明顯差異，可見完整的鈣化軟骨層結構。但軟骨缺損部位仍有部分凹陷，修復組織表面并未與關節(jié)表面平齊。
　　結論:
　　通過低溫凍干及京尼平交聯(lián)技術，利用含天然鈣化軟骨層脫細胞骨基質及Ⅱ型膠原

11、蛋白水凝膠可構建出含完整鈣化層結構的三層仿生骨軟骨支架，該支架結構良好，無明顯細胞毒性。其鈣化軟骨層具有生理性隔離帶作用，利用其生理性隔離帶作用，我們構建的雙室培養(yǎng)系統(tǒng)能為軟骨層及軟骨下骨層提供獨立的生長微環(huán)境。種子細胞在含天然鈣化軟骨層骨軟骨支架中生長良好，在誘導分化培養(yǎng)基的作用下，軟骨層及軟骨下骨層中的間充質干細胞可分別向成軟骨及成骨方向分化，且隨著培養(yǎng)時間的延長，支架內(nèi)種子細胞含量逐漸增加。在骨軟骨缺損修復實驗中，與空白對照及不含